一測多評法在五味子質(zhì)量控制中的應(yīng)用

一測多評法在五味子質(zhì)量控制中的應(yīng)用

五味子是木蘭科植物的五味子schidandarchnatica（turcz.）ball的干燥成熟果實，被稱為“北五味子”。木脂素類成分是五味子的主要藥用成分,具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗衰老等作用。目前已有同時測定五味子中多個木脂素類成分含量的相關(guān)報道,但這些方法難以在實際工作中廣泛應(yīng)用,其主要原因是對照品價格昂貴、有時難以獲得高純品,因此,如何實現(xiàn)對五味子多指標(biāo)成分的整體控制,是目前五味子質(zhì)量控制中有待解決的關(guān)鍵問題。本文建立五味子一測多評法(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker,QAMS),實現(xiàn)對五味子4種木脂素類成分的質(zhì)量控制,即選用其中使用廣泛的五味子醇甲,建立該成分與五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素間的相對校正因子,計算出各成分的含量,實現(xiàn)了用單一對照品對五味子藥材進行多指標(biāo)的質(zhì)量控制。高效液相色譜法材料與儀器五味子藥材均購自吉林,批號不同。五味子醇甲(110857-200405)、五味子酯甲(111529-200604)、五味子甲素(110764-201010)、五味子乙素(110765-200407)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純,水為超純水,甲醇為分析純。Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司),Agilentchemstation工作站;LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司),LCsolution工作站。KromasilC18(250mm×4.6mmID,5μm),DiamonsiC18(250mm×4.6mmID,5μm),HederaODS-2(250mm×4.6mmID,5μm)。液相色譜條件色譜柱KromasilC18(250mm×4.6mmID,5μm);流動相:A為乙腈,B為水,梯度洗脫條件,0~10min,A:41%~46%;10~45min,A:46%~66%;45~50min,A:66%~83%;50~55min,A:83%~83%;流速1mL·min-1,柱溫40℃,檢測波長254nm。對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷減壓干燥至恒重的五味子醇甲4.40mg、五味子酯甲5.91mg、五味子甲素4.12mg和五味子乙素5.37mg,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,精密移取上述4個對照品溶液各2mL,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,為混合對照品溶液。將上述混合對照品于4℃保存,備用。供試品溶液的制備取樣品粉末(過3號篩)各約1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率20kHz)40min,取出,加甲醇補足損失的量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,過0.45μm濾膜,即得。結(jié)果1方法研究1.1hplc-1的色度圖顯示了對照和樣品的色度圖1.2線性及歸歸方程精密吸取混合對照品溶液1、2、4、6、10、16和20μL,進樣分析,每個濃度進樣3次,取平均值。以進樣量對峰面積積分做標(biāo)準(zhǔn)曲線,用最小二乘法進行線性回歸,得到各對照品的回歸方程以及線性范圍,分別為五味子醇甲:Y=170.94X+0.0231,r=0.9999,線性范圍:0.0880~1.760μg;五味子酯甲:Y=163.50X-8.3701,r=0.9999,線性范圍:0.1182~2.364μg;五味子甲素:Y=175.58X-10.315,r=0.9999,線性范圍:0.0824~1.684μg;五味子乙素:Y=184.95X-10.895,r=0.9999,線性范圍:0.1074~2.148μg,表明得到的各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。1.3他組分m峰面積其中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積,Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度,Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m濃度。計算待評價成分五味子酯甲(B)、五味子甲素(C)和五味子乙素(D)與內(nèi)參物五味子醇甲(A)的相對校正因子,結(jié)果見表1。1.4儀器精密度試驗精密吸取同一濃度的供試品溶液10μL連續(xù)進樣6次,記錄五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積積分值,計算RSD,結(jié)果日內(nèi)精密度各成分峰面積的RSD分別為1.02%、1.71%、0.98%和1.18%,精密吸取同一供試品溶液10μL連續(xù)進樣2d,每天3次,記錄峰面積積分值,日間精密度各成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.61%、1.23%和1.36%,表明儀器精密度良好。液在2d內(nèi)穩(wěn)定。1.6重復(fù)性試驗結(jié)果稱取同一批五味子藥材粉末(過40目篩)約1g,精密稱定,按供試品制備方法制備6份供試品溶液,測定峰面積積分值,計算RSD,結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素穩(wěn)定性的RSD分別為2.36%、1.42%、1.54%和0.82%,表明該方法的重復(fù)性良好。1.7加樣回收率和rsd稱取已知含量的五味子藥材粉末1g(過40目篩)6份,精密稱定,加入一定量的混合對照品溶液各1mL,按供試品制備方法制備供試品溶液,測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的加樣回收率分別為99.8%、99.2%、100.5%和101.2%,RSD分別為1.31%、1.42%、0.77%和0.85%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。2重建因素的再現(xiàn)研究2.1相對校正因子的測定采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,精密吸取混合對照品溶液2、10和16μL,進樣分析,分別考察了Agilent1100和LC-20A2種不同高效液相色譜儀對五味子木脂素類成分相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子見表2,重現(xiàn)性良好(RSD<5%)。2.2藥代動力學(xué)測定結(jié)果采用Agilent1100高效液相色譜儀,精密吸取混合對照品溶液2、10和16μL,進樣分析,分別考察了KromasilC18、DiamonsiC18和HederaODS-2色譜柱對五味子木脂素類成分相對校正因子的影響,結(jié)果各成分相對校正因子見表3,重現(xiàn)性良好(RSD<5%)。2.3色譜峰的判別利用相對保留值(ras=tRa/tRs)定位,即根據(jù)內(nèi)參物的保留時間、待測組分的相對保留值和色譜峰的紫外吸收特征,便能夠正確判斷出目標(biāo)峰的位置。分別考察了2種高效液相色譜儀和4種不同型號色譜柱下對比參數(shù),結(jié)果可知RSD<5%,表明可利用相對保留值(表4)進行定位。3相色譜法分別精密吸取13批五味子藥材供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀測定。采用外標(biāo)法和一測多評法計算五味子藥材中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量,結(jié)果表明2種含量測定方法無顯著性差異,RSD≤1.6%,見表5。提取方法的確定選擇五味子醇甲為內(nèi)參物是因為五味子醇甲為藥典規(guī)定五味子質(zhì)量控制指標(biāo)性成分,且該對照品易得。根據(jù)目標(biāo)峰與內(nèi)參物峰之間的相對保留值,結(jié)合各峰的紫外吸收特征、峰形等信息,即能夠正確判斷出各目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置?？疾炝?種不同高效液相色譜儀和3種不同品牌色譜柱對五味子木脂素類成分相對校正因子的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)?？疾炝?0%甲醇、70%甲醇、85%甲醇、純甲醇和無水乙醇對五味子中4種木脂素類成分提取率的影響,結(jié)果表明以純甲醇提取4種成分提取率均最高,且提取雜質(zhì)較少。以純甲醇為提取溶劑,考察超聲和回流兩種提取法對4種木脂素類成分提取率的影響,結(jié)果表明超聲40min和回流2h提取4種成分提取率無顯著差異,考慮回流時間長,操作較繁瑣,所以選擇超聲法為提取方法。以甲醇為溶劑,分別超聲30min、40min、50min和1h,結(jié)果表明40min后4種成分提取率無明顯增加。所以最終確定以純甲醇做提取溶劑超聲40min為制備供試品溶液方法。比較了甲醇-水和乙腈-水不同比例梯度洗脫效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水洗脫分離效果好于甲醇-水,達到基線分離,尤其在五味子酯甲分離上尤為明顯,且甲醇-水洗脫柱壓較大,所以選擇乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)為流動相。采用一測多評法所得五味子藥材中4種木脂素類成分含量與常規(guī)的外標(biāo)法所測得的含量間無顯著差異,說明在無對照品的情況下,通過一測多評法實現(xiàn)五味子藥材同類成分的含量測定準(zhǔn)確可行。對于不同類型成分應(yīng)用一測多評法的可行性還需進一步探