一測多評法在淫羊藿中的方法學(xué)考察

一測多評法在淫羊藿中的方法學(xué)考察

綿羊：男性植物小科祥、箭葉關(guān)鍵詞：sagistatum、柔軟的頭發(fā)、菖蒲、山西人、流行性感冒、日本電視臺的干燥區(qū)域。其具有補腎陽,強(qiáng)筋骨,祛風(fēng)濕。用于陽痿遺精,筋骨痿軟,風(fēng)濕痹痛,麻木拘攣;更年期高血壓。目前已有同時測定淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷這4個指標(biāo)成分含量的報道,但這些方法難以在實際工作中廣泛應(yīng)用,其主要原因是由于一些對照品(如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)價格昂貴且難以獲得,這直接限制了用常規(guī)的外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法實現(xiàn)其多指標(biāo)質(zhì)量控制的設(shè)想。在對成分復(fù)雜的中藥進(jìn)行質(zhì)量評價的過程中,由于中藥成分之間具有相互協(xié)同作用的特點以及先進(jìn)分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用,選擇單一成分進(jìn)行質(zhì)量評價的傳統(tǒng)方法已經(jīng)逐漸被同時測定多種有效成分的方法所取代,“一測多評”的研究思路已經(jīng)在木通、人參、黃芪、梔子等藥材中得到驗證,本文將一測多評法應(yīng)用于淫羊藿藥材的質(zhì)量控制,實現(xiàn)其多成分的同步測定。1儀器與試藥JASCOPU-980高效液相色譜儀(JASCO日本分光公司),JASCOUV-925紫外-可見光檢測器,ANASTAR色譜工作站;Shimadzu高效液相色譜儀(日本島津公司),SPD-10Avp紫外檢測器,ANASTAR色譜工作站;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。12批淫羊藿藥材分別購自青海、新疆、吉林、四川等地。樣品經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院孫啟時教授鑒定,購自上海和湖南的藥材為柔毛淫羊藿E.pubescens,購自湖北的藥材為巫山淫羊藿E.wushanense,其余均為朝鮮淫羊藿E.koreanum。朝藿定A(批號A0228)、朝藿定B(批號A0229)、朝藿定C(批號A0230)對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司,HPLC(峰面積歸一化法)純度≥98%,淫羊藿苷(批號110737-200312)購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(批號100108),色譜純,天津市康科德科技有限公司,水為實驗室自制重蒸水,其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1方法原理一測多評法(Quantitativeanalysismulti-componentsbysinglemarker,QAMS)是指在多指標(biāo)質(zhì)量評價時,以藥材中某一典型組分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo),建立該組分與其他組分之間的相對校正因子,通過校正因子計算其他組分的含量。fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×AkAk為內(nèi)標(biāo)物峰面積,Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度,Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m濃度。2.2一測多評方法學(xué)考察2.2.1色譜條件DiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈-水(25∶75),柱溫30℃;流速1.0mL·min-1,檢測波長為270nm,見圖1。2.2.2對照品溶液的制備取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,加甲醇配置成濃度分別為66.7,102,40.8,188mg·L-1的儲備液。另取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解,配置成0.115,0.299,0.328,0.250g·L-1的混和標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存于4℃冰箱中,備用。2.2.3供試品溶液的制備取淫羊藿藥材粉末(過60目篩)1g,精密稱定,至于100mL具塞錐形瓶中,精密量取20mL50%乙醇加入,稱重,超聲20min(140W,頻率40kHz),再稱重,以50%乙醇補足重量,離心(13000r·min-1,10min),經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,10μL進(jìn)樣。2.2.4線性關(guān)系考察分別精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。分別精密吸取上述混合對照品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定,記錄峰面積。以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表1,各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好。2.2.5校正因子的計算在上述色譜條件下,分別測定不同進(jìn)樣體積時,以淫羊藿苷(Icarrin,簡稱i)為內(nèi)標(biāo),朝藿定A(epimedinA,簡稱A)、朝藿定B(epimedinB,簡稱B)、朝藿定C(epimedinC,簡稱C)的相對校正因子f,見表2。2.2.6精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積,得出日內(nèi)精密度分別為2.1%,2.2%,2.3%和1.2%;連續(xù)進(jìn)樣3d,每天6次,記錄峰面積,以上4種指標(biāo)成分日間精密度分別為2.4%,1.2%,2.2%,1.4%。2.2.7供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液(吉林),分別于0,2,4,8,12,24h,注入高效液相色譜儀,依法測定,記錄峰面積,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷穩(wěn)定性的RSD分別為2.2%,1.2%,2.6%,1.3%。表明處理后的樣品在1d內(nèi)穩(wěn)定。2.2.8重復(fù)性試驗按上述供試品溶液制備方法,稱取同一批淫羊藿藥材粉末(吉林)約1g,共6份,分別進(jìn)行測定,測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均含量分別為0.467,0.797,0.467,1.691μg·g-1,RSD分別為2.1%,2.1%,2.2%,1.1%。2.2.9回收率試驗采取加樣回收率法(按1∶1加入),取同一批已知含量的淫羊藿藥材粉末(吉林)約0.5g,6份,精密稱定,分別精密加入一定量的2.2.2項下朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品溶液,按2.2.3項下方法制備供試品溶液,精密吸取上述供試品溶液10μL,依法測定,計算回收率,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加樣回收率分別為97.6%,99.5%,100.1%,97.4%,RSD分別為2.8%,1.8%,2.2%,2.1%。2.3校正因子的重現(xiàn)性考察2.3.1色譜柱及高效液相色譜儀考察精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液1,2,4,6,8,10μL,進(jìn)樣分析,按2.1項下方法計算試驗考察了Shimadazu,JASCO兩種高效液相色譜系統(tǒng)和DiamonsilC18(4μm×250mm,5μm),EliteHypersilDBS(4μm×250mm,5μm),PhemomenexGeminiC18(4μm×250mm,5μm)3種色譜柱,見表3。2.3.2待測組分色譜峰的定位在只使用一個對照品時,如何正確指認(rèn)藥材中其他3個待測成分是一個必須解決的問題。本文采用相對保留值α(待測成分與內(nèi)標(biāo)調(diào)整保留時間之比)作為定位標(biāo)準(zhǔn),并在不同品牌高效液相色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下對此參數(shù)進(jìn)行考察,見表4,各成分的相對保留值α波動較小,RSD≤5%,表明利用α值進(jìn)行峰的定位是可行的。2.4淫羊藿藥材含量測定一測多評法與常規(guī)法的結(jié)果比較分別稱取淫羊藿藥材粉末(過60目篩)約1.0g(n=3),精密稱定,按2.2.3項下方法制備各供試品溶液,精密吸取各供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,依法測定。采用外標(biāo)法和一測多評法計算不同產(chǎn)地及不同種類的淫羊藿藥材中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量,見表5。常規(guī)的外標(biāo)法實測含量值與一測多評計算的含量值經(jīng)t檢驗比較,P>0.05,表明2種方法測得結(jié)果沒有顯著性差異。由此說明一測多評法可用于淫羊藿藥材的多成分質(zhì)量評價研究。3討論在查閱文獻(xiàn)、借鑒前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,本試驗分別考察了20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%乙醇8種提取溶劑,超聲、回流不同提取方法,發(fā)現(xiàn)采用20mL50%乙醇超聲20min提取,能夠兼顧上述4種黃酮類成分,得到滿意的提取率,且方法簡單,故選用50%乙醇超聲20min作為本試驗的提取條件。本實驗選用淫羊藿苷作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行QAMS(一測多評法)是由于淫羊藿苷為淫羊藿中主要有效成分,且該對照品價廉易得。針對只使用單個對照品如何正確定位淫羊藿藥材中其余3個目標(biāo)色譜峰的問題,本文引入了相對保留值α這種參數(shù)作為定位標(biāo)準(zhǔn),并考察了3根不同品牌的色譜柱和兩種高效液相色譜系統(tǒng),比較結(jié)果顯示,采用相對保留值更能夠準(zhǔn)確定位上述目標(biāo)色譜峰。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷是淫羊