響應(yīng)面法優(yōu)化谷胱甘肽提取工藝

響應(yīng)面法優(yōu)化谷胱甘肽提取工藝

谷岡甘醇是含有l(wèi)-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸的三醇化合物。它是由含有糊精的生物活性三醇化合物（gsh）和氧化（gssg）組成的。GSH是機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì),它具有清除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收及維持紅細(xì)胞膜的完整性,維持DNA的生物合成,細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫等多種生理功能。臨床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治療、有機(jī)物及重金屬的解毒、癌癥輻射和化療的保護(hù)。在食品、醫(yī)藥、保健品、化妝品工業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外關(guān)于谷胱甘肽的制備方法主要有:生物提取法、發(fā)酵法、吸附層析柱法、化學(xué)合成法及酶法等,其中水提取法應(yīng)用較廣,具有一定的優(yōu)勢(shì),其提取原料多為啤酒廢酵母。目前應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化啤酒廢酵母提取還原型谷胱甘肽工藝的方法還未見報(bào)道。為此,我們以啤酒廢酵母為原料,以谷胱甘肽提取得率為指標(biāo),并通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)對(duì)影響谷胱甘肽提取工藝的主要影響因素料水比、提取時(shí)間、溫度和醋酸用量進(jìn)行分析和優(yōu)化,為谷胱甘肽的規(guī)?；a(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1材料和試劑新鮮啤酒酵母河南南街村集團(tuán)南德啤酒廠。所用試劑均為分析純。1.2設(shè)備和設(shè)備電子天平、電熱恒溫水浴鍋、pH計(jì)、離心機(jī)、顯微鏡等。1.3方法1.3.1離心酒花lma按1:1(V/V)的比例將啤酒廢酵母泥加入超純水中洗滌,并經(jīng)100目篩子過(guò)篩,然后以3000r/min離心10min,如此3次,以除去其中的酒花等雜質(zhì)。稱取一定量的酵母泥,按料水比1:4的比例加入超純水,并添加3%~5%的醋酸,于40℃水浴攪拌5h,置冰箱中冷卻至室溫,用2mol/L鹽酸調(diào)pH3.0,以3000r/min離心10min可得谷胱甘肽(GSH)抽提液。1.3.2測(cè)量1.3.2.1.祖母細(xì)胞破壁計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板法。1.3.2.gsh含量的測(cè)定取樣品1ml加入3ml0.15mol/LNaOH溶液中,搖勻,此時(shí)溶液pH≥12,再加入φ=0.03甲醛1ml,搖勻,靜置2min,立即取1ml加入到5ml現(xiàn)配的DTNB溶液中,搖勻,25℃水浴靜置5min后,于412nm處測(cè)定的吸光度,將該吸光度乘以1.02,根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定樣品中GSH的含量。2提取率的影響根據(jù)周楠迪等對(duì)GSH的提取的研究,發(fā)現(xiàn)料水比、提取時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)GSH的提取率影響較大。同時(shí)考慮到還原型谷胱甘肽容易氧化的特點(diǎn),若在提取中添加一定量的醋酸,形成酸性環(huán)境,可使提取的谷胱甘肽處于穩(wěn)定的狀態(tài)。因此,通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響谷胱甘肽提取效果的主要因素:料水比、提取時(shí)間、溫度和醋酸用量進(jìn)行初步研究。2.1谷胱甘肽提取在谷胱甘肽提取中,料水比對(duì)酵母的自溶有直接的影響,也會(huì)對(duì)谷胱甘肽的提取形成影響。因此,取具有不同的料水比的酵母原料,調(diào)pH6.0(添加3%的醋酸),于40℃水浴攪拌5h,進(jìn)行谷胱甘肽提取,其結(jié)果見圖1。從圖1可見,隨著料水比的增加,谷胱甘肽提取率在不斷的提高,但料水比達(dá)到1:4以后增加幅度不大。因此,在生產(chǎn)中綜合節(jié)水和提取負(fù)荷考慮,選料水比為1:4較為合適。2.2谷胱甘肽得率測(cè)定取料水比為1:4的酵母原料,調(diào)pH6.0(添加3%的醋酸),在40℃水浴攪拌下進(jìn)行自溶,隨著自溶的進(jìn)行,谷胱甘肽得率會(huì)隨時(shí)間而發(fā)生變化,結(jié)果見圖2。由圖2可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),谷胱甘肽得率在5h左右達(dá)到最高,自溶的進(jìn)行,因此,可初步確定谷胱甘肽提取時(shí)間為5h左右。2.3谷胱甘肽提取率測(cè)定溫度不僅對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝有著直接的影響,對(duì)谷胱甘肽的穩(wěn)定性也有一定的影響,取料水比為1:4的酵母原料,調(diào)pH6.0(添加3%的醋酸),分別在20、30、40、50、60、70及80℃條件下,攪拌自溶5h,觀察谷胱甘肽提取得率的變化,結(jié)果如圖3。由圖3可見,當(dāng)溫度超過(guò)40℃后谷胱甘肽(GSH)的含量急劇下降,可見溫度對(duì)GSH的穩(wěn)定性影響較大,因此,谷胱甘肽提取的最高溫度應(yīng)低于40℃。2.4谷胱甘肽得率測(cè)定酵母的自溶是在其體內(nèi)酶的作用下進(jìn)行的,而環(huán)境的pH值將直接影響其體內(nèi)酶的活性。取料水比為1:4的酵母原料,添加不同量的醋酸,于40℃水浴攪拌自溶5h,觀察其抽提液中谷胱甘肽得率的變化,結(jié)果見圖4。從圖4可知,當(dāng)醋酸添加量在3.5%左右時(shí)間,GSH存在的環(huán)境pH為5.0~6.0,此時(shí)GSH得率最高。2.5改善中俄固甘醇提取工藝的條件2.5.1響應(yīng)面法優(yōu)化谷胱甘肽提取綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則,選擇對(duì)谷胱甘肽提取影響較大的三個(gè)因素:提取時(shí)間、提取溫度和醋酸添加量,分別以X1、X2和X3代表,以谷胱甘肽提取得率為評(píng)判指標(biāo),采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,各因素及水平編碼如表1所示。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。2.5.2谷胱甘肽提取得率的顯著性分析應(yīng)用DesignExpert軟件,對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng),可得提取時(shí)間、提取溫度和醋酸添加量與谷胱甘肽提取得率間的二次多項(xiàng)回歸方程:對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。由表3可知,該模型回歸顯著(p<0.0001),方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的,且交互項(xiàng)X1X3、X2X3也顯著,且該模型的R2=0.9914、R2Adj=0.9804,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好,可用于酵母谷胱甘肽抽提工藝的理論預(yù)測(cè)。2.5.3不同種類組合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了驗(yàn)證谷胱甘肽提取模型的有效性,在提取時(shí)間(h)、提取溫度(℃)和醋酸添加量的試驗(yàn)水平范圍內(nèi),選擇3個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。從表4可看出,模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相吻合極好,可利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。2.5.4效果分析與評(píng)價(jià)由回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖,見圖5、6。通過(guò)該組圖即可對(duì)任何兩因素交互影響谷胱甘肽提取得率的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù),當(dāng)響應(yīng)值Y有最大值時(shí)可求得各因素的水平:X1=0.26、X2=0.36、X3=0.05,轉(zhuǎn)換后可得谷胱甘肽的最佳提取條件:在料水比1:4、溫度43.6℃的條件下,添加3.5%的醋酸,提取5.5h。此時(shí)谷胱甘肽的提取得率可達(dá)到29%以上。3響應(yīng)面分析法優(yōu)化谷胱甘肽提取的最佳工藝?yán)肂ox-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法,借助Design-Expert軟件能簡(jiǎn)便,可靠地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到谷胱甘肽提取的最佳工藝。實(shí)踐證明采用響應(yīng)面分析法對(duì)谷胱甘肽提取的最