抗腫瘤藥物的篩選與篩選

抗腫瘤藥物的篩選與篩選

腫瘤是一種常見的疾病，嚴重威脅著人類的生活質(zhì)量。他被稱為人類健康的第一殺手。多年來人類一直在不斷的進行抗腫瘤藥物的研究,抗腫瘤藥物的篩選是整個研究過程中很重要的一個環(huán)節(jié),而進行藥物的篩選首先離不開合理的篩選方法和系統(tǒng)。尋找選擇性強﹑對實體瘤有效的新型抗腫瘤藥物,是擺在抗腫瘤藥物研究人員面前的重要任務。世界各國對抗腫瘤藥物的篩選都非常重視,投入了大量的人力﹑物力﹑財力,每年都有大量的化合物(合成藥﹑天然產(chǎn)物和微生物發(fā)酵產(chǎn)物)待篩,抗腫瘤藥物篩選方法的發(fā)展經(jīng)歷了一個探索的過程。80年代中期以前,普遍采用的篩選方法是以體內(nèi)小鼠白血病/淋巴瘤模型P388和L1210為基礎的,所有化合物在進一步的臨床研究之前必須通過這種小鼠腫瘤模型的篩選。即小鼠白血病P388和L1210作為第一輪初篩,能通過第一輪初篩的化合物才能被允許進入第二輪篩選。這種方法有一個很明顯的缺陷就是一些在臨床上有活性的藥物將被篩選掉,無法保證所有具有抗腫瘤作用的藥物都能通過篩選。鑒于以前的篩選方法存在較大的缺陷,1985年之后以NCI為首的一些研究單位普遍開始采用針對疾病的篩選方法來代替針對化合物的篩選方法,即放棄體內(nèi)小鼠篩選,代之為體外代表各種常見實體瘤的人類腫瘤細胞株篩選。這種篩選系統(tǒng)是一種高通量的抗腫瘤篩選體系,其主要優(yōu)勢有兩點:其一是多種細胞株初篩有可能篩選出對特殊的人類腫瘤或?qū)μ厥饨M織亞型有活性的物質(zhì);其二是這種體外篩選尤其適合于復雜天然產(chǎn)物提取物中有效成份的證實,過去動物篩選需較大量的天然產(chǎn)物,而現(xiàn)在天然產(chǎn)物的需要量就大大減少,可以指導有效成份的進一步分離純化,使得從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物更加便利。下面對現(xiàn)階段較為普遍采用的一些抗腫瘤藥物的篩選方法做進一步的闡述。1端粒酶活性的檢測端粒是染色體特殊結(jié)構,起著保護染色體的完整和穩(wěn)定性的作用,端粒酶是一種核糖核蛋白返轉(zhuǎn)錄酶,由RNA和蛋白質(zhì)組成,可以以自身的RNA為模板合成端粒末端。已發(fā)現(xiàn)在正常的體細胞和良性腫瘤組織中端粒酶活性是陰性,而在人體惡性腫瘤組織和人的腫瘤細胞株中都表達了很高的活性。因此,認為端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系,有可能成為腫瘤治療的靶點。為了準確測定端粒酶的活性,現(xiàn)普遍采用端粒重復擴增法(telomericrepeatamplify-caionprotocol,簡稱TRAP)參照Kim等人方法,但有部分改進。具體方法如下所述。1.1pcr擴增pcr取細胞酶提取液1μL分別加入TS引物0.36μmol/L,dNTP50μmol,TaqDNA多聚酶1IU,CX引物0.28μmol/L,Mg2+1.5mmol,在25μL反應液中進行PCR擴增。擴增程序為在30℃反應30min,72℃30s,然后在94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,進行30個循環(huán)。1.2聚丙烯酸凝膠電泳分析和開發(fā)區(qū)用12%丙烯酰胺灌膠,膠聚合后,取擴增產(chǎn)物1025微升加入加樣孔,以180V的電壓進行電泳2h左右。1.3顯色凝膠的制備用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝膠35min,然后加入硝酸銀溶液(最終濃度為0.2%),在37℃水浴上振蕩染5min,用超純水洗滌三次。再加入顯色液(30%的NaOH和0.1%的甲醛)振蕩直至DNA條帶出現(xiàn),一般為20min。最后將顯色凝膠移至固定液中固定5min。普通光源照像。1.4端粒酶活性的判斷由于端粒是由短DNA重復序列組成,而端粒酶的作用是維持端粒末端的長度,因此可以用PCR擴增產(chǎn)物間接反映端粒酶活性。即在DNA條帶中顯示出6bp的梯狀條帶,則判斷端粒酶的活性依然存在為陽性。惡性腫瘤治療的理想靶點應該是尋找到一種對腫瘤細胞生長所必須,但又不存在于正常細胞的物質(zhì)。端粒酶就是一種在許多腫瘤組織中處于高表達活性,而在正常組織中卻沒有酶活性表達的特殊核糖核蛋白物質(zhì)(除生殖和造血干細胞外)。它在維持腫瘤細胞的高度增殖時,對端粒的縮短起著重要的作用,從而提示端粒酶可能是惡性腫瘤組織的一個標志。2活細胞的檢測快速熒光素測定法是一種近幾年發(fā)展起來的應用非常廣泛的體外藥物敏感性測定方法,其原理為采用一些特殊的熒光染料,對細胞的特定成份進行染色或標記?；蛲ㄟ^細胞酶的作用使無熒光性的材料分解或轉(zhuǎn)換為熒光材料,通過測定熒光強度從而測定出活細胞的量?，F(xiàn)在普遍采用一種特殊的熒光染料FDA(Fluoresceindiacetate),在正常情況下它不具有熒光,但當它加入到具有完整細胞膜的腫瘤細胞的營養(yǎng)液中時,由于細胞分泌的水解酶的作用,FDA水解釋放出具有強烈熒光的熒光素。死亡的細胞由于其機能已受到抑制或破壞,FDA水解水平大大降低,這樣通過測定培養(yǎng)液中熒光的強度,就能測定活細胞的數(shù)量,從而測定出藥物對細胞的作用,推測其抗腫瘤的效果。2.1細胞不加藥物該實驗采用體外培養(yǎng)的不同種腫瘤細胞系,經(jīng)0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm離心,稀釋至細胞濃度為5×104個/mL。每組3-4個平行孔,接種在微孔培養(yǎng)板中,對照組只加細胞不加藥物。37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。2.2終濃度0.0.0.5.4%常規(guī)傳代細胞待貼壁后,每孔加藥,使藥液終濃度為0.1ug/mL,0.5ug/mL,1ug/mL,5ug/mL,10ug/mL,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至最佳作用時間。2.3熒光強度測定培養(yǎng)至最佳作用時間的細胞移去培養(yǎng)液,用PBS緩沖液沖洗兩遍,準確加入1.8mL/孔PBS緩沖液,隨后加入200uL/孔含F(xiàn)DA的DMSO儲備液(100ug/mL),使其終濃度為10ug/mL,搖勻后,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)1h,用熒光分光光度儀RF-540在激發(fā)光波長為485nm,發(fā)散光波長為538nm,狹縫為2nm,衰減為5(×16)的條件下測定每孔溶液的熒光強度值。熒光素測定法具有快速﹑靈敏﹑準確性高﹑重現(xiàn)性好的特點,其細胞測定范圍寬﹑線性好,適用于大量抗腫瘤藥物的篩選和臨床抗腫瘤藥物的預試。3結(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫染色測定法是由Gillies等于1986年提出來的一種單層細胞培養(yǎng)的體外藥物敏感性測定方法。其原理是結(jié)晶紫染色可通過細胞的特定攝生法而選擇性地被細胞核吸收,死亡的細胞幾乎不吸收結(jié)晶紫染料。而被核(DNA)吸收的結(jié)晶紫又可為有機溶媒提取,通過測定提取液的光密度值(OD),就可測定活細胞的數(shù)量。近幾年經(jīng)過不斷改進,結(jié)晶紫染色法已能適用于大量抗腫瘤藥物的藥敏測定,具有靈敏度高﹑重現(xiàn)性好的特點。實驗方法如下。3.1細胞不加量檢測實驗采用體外培養(yǎng)細胞系,經(jīng)0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm離心,稀釋至細胞濃度為5×104個/mL。每組4個平行孔,接種在微孔培養(yǎng)板上?？瞻卓字患訝I養(yǎng)液不加細胞,對照孔只加細胞不加藥物。37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。3.2濃度為0.0.0.5%的情況常規(guī)傳代細胞待貼壁后,每孔加藥液,使藥液終濃度為0.1μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL等。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)至最佳作用時間。3.3結(jié)晶紫的提取至最佳作用時間的細胞用11%的戊二醛固定,搖20min,使細胞停止生長,達到實驗結(jié)果的均一性。固定后的細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗凈。37℃烘干。加入0.1%的結(jié)晶紫液對細胞染色。振搖30min,用蒸餾水洗滌,至剩余的結(jié)晶紫液沖洗干凈。37℃烘干。加入10%的乙酸對細胞吸收的結(jié)晶紫進行提取,1h后在波長為595nm處測定。結(jié)晶紫染色測定法具有快速﹑靈敏﹑準確性高﹑重現(xiàn)性好的特點,是一種較好的抗腫瘤藥物的篩選方法。4誘導噬菌體—應用噬菌體篩選抗腫瘤藥物已確證多種病毒能引起動物腫瘤,噬菌體是細菌的病毒,與腫瘤病毒相似,噬菌體的DNA也可整合到細菌染色體上,隨細菌DNA復制分裂并傳至子代細菌,不引起細菌裂解但可引起細菌部分生物學性狀發(fā)生改變。有些物質(zhì)可使前噬菌體DNA從溶原性細菌染色體上脫落,復制合成并釋放出完整的噬菌體,致使敏感的細菌感染裂解,這種作用稱為誘導作用。有些有誘導作用的物質(zhì)常同時具有抗腫瘤作用,因此在研究腫瘤病毒—腫瘤細胞間關系時,常與溶原性噬菌體—溶原性細菌模型相比擬,同時啟發(fā)人們用“誘導噬菌體作用”篩選抗腫瘤藥物,并且已經(jīng)取得一定成效。實驗方法(雙層瓊脂平板—紙片法)如下:(1)用pH7.4之2%固體瓊脂傾注于平皿底部,厚為2mm,凝固后待用。(2)取100mlpH7.4之0.7%半固體營養(yǎng)瓊脂,溶化后冷卻至50℃,加入培養(yǎng)18h并已稀釋10-4之金色葡萄球菌75培養(yǎng)液4mL及培養(yǎng)18h未稀釋之金色葡萄球菌47培養(yǎng)液4mL,混勻后,傾入平板上層,厚約1mm。(3)上層瓊脂凝固后,用6mm直徑之無菌圓形濾紙片1片,沾取待篩藥物浸膏貼于平板上,另以爭光霉素為陽性對照,于37℃中培養(yǎng)。(4)24h后觀察結(jié)果,陽性結(jié)果:溶原性細菌釋放多量成熟的嗜菌體,侵入指示菌體內(nèi)繁殖,而使指示菌裂解,在濾紙片周圍出現(xiàn)密集之噬斑。陰性結(jié)果:濾紙片周圍與背景相同。通過實驗證明,具有誘導噬菌體作用的藥物大多具有抗腫瘤作用,且用噬菌體—細菌間特性建立的篩選模型具有簡便﹑迅速﹑適宜大量藥品篩選的特點,可以廣泛應用于抗腫瘤藥物的篩選。5阻斷致瘤病毒復制腫瘤的發(fā)生是一種多步驟﹑多因素作用的疾病,其中病毒是腫瘤發(fā)生重要的環(huán)境因素之一。目前已明確許多病毒與人類惡性腫瘤的發(fā)生有關,這些病毒基因在細胞內(nèi)復制﹑表達﹑通過多種不同的途徑,導致細胞向惡性轉(zhuǎn)化,引起腫瘤的發(fā)生。隨著病毒致瘤的機制逐漸被闡明,阻斷致瘤病毒復制將成為抗腫瘤藥物篩選的基本策略之一?？梢酝ㄟ^對以下機理的了解,來篩選抗腫瘤藥物。5.1阻止病毒與靶細胞的結(jié)合和融合病毒感染的最初步驟就是病毒顆粒吸附于靶細胞,并通過與靶細胞受體結(jié)合而與靶細胞融合形成合胞體,抗體和疫苗可以阻斷病毒與靶細胞的結(jié)合。5.2類藥物抑制病毒復制病毒進入細胞后,DNA的復制需要核苷類化合物,應用核苷類藥物不僅可以抑制病毒復制的酶,而且可以競爭性地進入細胞后磷酸化,滲合到病毒復制的DNA中,阻斷DNA鏈的延長,抑制病毒復制。這方面的藥物包括核苷類和開環(huán)核苷類。5.3抑制病毒復制的酶(1)抑制imp脫氫酶次黃嘌呤核苷酸脫氫酶是嘌呤單核苷酸生物合成的關鍵酶,負責將IMP轉(zhuǎn)換成黃嘌呤核苷酸,并進一步形成GMP,GDP和GTP以及從GDP經(jīng)dGDP到dGTP,抑制IMP脫氫酶可以影響RNA和DNA的合成。雖然IMP脫氫酶被認為是細胞的靶標,但是這樣的合成在病毒感染的細胞中,需求量將增大。因此IMP脫氫酶的抑制被認為主要是影響病毒RNA和/或DNA的合成。(2)抑制反向轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴RNA的DNA聚合酶,一些致瘤性病毒就是通過逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA作為模板合成DNA,設法阻斷這一過程可阻斷病毒復制。(3)蛋白水解顆粒的制備蛋白酶是一種催化肽鏈水解的酶,由于病毒表達的結(jié)構蛋白和酶是一類大的多聚蛋白體可裝配成傳染性的子代病毒,必須依賴蛋白酶對多聚蛋白體進行水解,如果病毒蛋白酶被抑制則不能裝配成具傳染性的顆粒。以上所述都是一些阻止病毒復制的方法,而病毒與惡性腫瘤的生成有著密切的關系,有效的阻止病毒的復制往往就能使惡性腫瘤的發(fā)生率大大降低,因此正確判斷一種藥物是否具有阻止病毒復制的功能是進行抗腫瘤藥物篩選的一個重要方面。6關于實現(xiàn)中藥作用的方法我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥在腫瘤的治療方面有其獨特的理論,天然中藥以其療效廣泛﹑確切﹑毒性低受到國內(nèi)外的廣泛關注。近年來,從中藥中提取抗腫瘤有效成份日益得到人們的重視,因此確立一套篩選抗腫瘤中藥有效成份的方法也就越來越有必要了。經(jīng)過長時間的摸索,除以上所述的幾種方法外,對具有抗腫瘤作用中藥的篩選己形成了一套具有自身特點的方法,現(xiàn)在一般采取的方法是選取幾種腫瘤細胞系,以培養(yǎng)細胞為實驗模型,用MTT實驗﹑軟瓊脂等方法,在細胞水平檢測中藥提取物或單體的體外抗腫瘤作用,篩選出能夠以較低濃度抑制腫瘤細胞生長或增殖的藥物。在此基礎上,以荷瘤小鼠為實驗模型,在動物水平檢測其在體抑瘤作用。具體方法如下:6.1細胞水平的選擇(1)dmso處理細胞培養(yǎng)腫瘤細胞用含10%熱滅活的小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃,5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。藥物處理將中藥單體或提取物分別溶于DMSO,作用于培養(yǎng)細胞體系。藥物濃度在0.005至0.5(mg/mL)之間,等量DMSO作為陰性對照。培養(yǎng)體系中溶劑濃度不超過1%。培養(yǎng)24h后,顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。體外藥物敏感性分析針對藥物單體,以幾種腫瘤細胞系為實驗模型,以MTT實驗法分析其體外抗腫瘤活性。(2)細胞培養(yǎng)和集落形成首先制備底層瓊脂,將其加入12孔板中,每孔2mL室溫放置1h以上,待其充分凝固。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞用含0.01%EDTA的0.25%胰蛋白酶進行消化,用培養(yǎng)基稀釋成單細胞懸液,并調(diào)整濃度至1×104個細胞/mL。然后取42℃預溫的瓊脂粉/培養(yǎng)基混合物1.2mL與0.8mL含有不同藥物的細胞懸液迅速混勻,取1mL鋪于底層瓊脂之上,每個樣品設3個復孔。置室溫待其充分凝固后,于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。在顯微鏡下觀察集落形成情況并計數(shù)。集落計數(shù)方法:在鏡下隨機記數(shù),每一孔中5個視野內(nèi)的集落數(shù)(集落確定標準:4個細胞以上),計算各自總和,取3復孔的平均數(shù)做比較。(3)細胞毒性試驗合成化合物或植物提取物純品的半數(shù)抑制濃度IC50<10ug/mL,或植物粗提物的IC50<20ug/mL,并且有細胞毒性的劑量依賴關系,且最高抑制效率達80%以上,則判定樣品在體外對細胞有殺傷作用。6.2動物水平的選擇(1)注射方式及藥物分三組,每組三只。藥物溶于橄欖油,以腹腔注射方式給藥,陰性對照組只注射橄欖油,試驗組同時注射待篩選藥物,200mg/kg體重,2天1次。觀察給藥后行為,為期4周。(2)細胞成瘤的測定將小鼠背部皮下接種2×106H22小鼠肝實質(zhì)瘤細胞,5-7天后可見成瘤。將40只荷瘤小鼠隨機分為四組,藥物溶于橄欖油,腹腔注射給藥,試驗為期10周。處死小鼠后,收取腫瘤標本,稱量腫瘤重量。(3)療效評價標準實體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示,即瘤重抑制率=(1-試驗組瘤重/對照組瘤重)×100%,中藥抑制率大于30%,合成藥大于40%,且有統(tǒng)計學意義,重復3次,療效穩(wěn)定,則評價有一定抗腫瘤作用。7新靶點、新化合物的發(fā)現(xiàn)和應用如今,抗腫瘤藥物的篩選已經(jīng)由針對化合物的篩選體系轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍膊〉暮Y選體系,但目前所應用的篩選系統(tǒng)只適合于隨機篩選,比較理想的篩選體系應該是以機理為基礎的或針對機理的篩選系統(tǒng)。近年來分子腫瘤學的研究所取得的進