紫外分光光度法測(cè)定啤酒酵母中甘露糖的含量

紫外分光光度法測(cè)定啤酒酵母中甘露糖的含量

當(dāng)不同糖混合且各糖含量相同時(shí)，很難測(cè)定每克糖的含量。3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法,Somogyi-Nelson法定量的是總還原糖。苯酚-硫酸法,蒽酮法是將糖轉(zhuǎn)變成糖醛或其衍生物,然后與苯酚或蒽酮起顯色反應(yīng)進(jìn)行定量,所測(cè)定的是總糖,缺乏特異性。離子色譜、高效液相色譜和氣相色譜可以快速準(zhǔn)確地分離定量各種糖,然而需要對(duì)樣品進(jìn)行一系列繁瑣的預(yù)處理,并且目前一般實(shí)驗(yàn)室,特別是企業(yè)尚不具備這些儀器設(shè)備。因此,建立一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確定量甘露糖的實(shí)驗(yàn)室方法,對(duì)于研究開(kāi)發(fā)富含甘露糖的碳水化合物具有較大的使用價(jià)值。1材料和方法1.1設(shè)備和設(shè)備紫外掃描儀:日本島津UV-240型;紫外分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠UV-754型;恒溫水浴鍋;具塞試管。1.2試劑和材料1.2.1試劑試劑包括甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、酵母RNA、濃硫酸、氯化鈉、硼酸。以上試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2.2材料表面啤酒酵母,無(wú)錫獅王太湖水啤酒有限公司提供。1.3方法1.3.1硫酸水解硫酸準(zhǔn)確稱取一定量的啤酒酵母(10～20mg),加入72%H2SO425ml,不斷碾磨使其溶解,室溫放置1h,然后加蒸溜水至硫酸濃度1mol/L左右,100℃水解10h,最后定容至100ml。1.3.2nacl-h3bo3-u3000添加量的確定準(zhǔn)確配制甘露糖濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200μg/ml的系列溶液,取兩支具塞試管,在A試管中加入0.2ml甘露糖溶液,0.2mlNaCl-H3BO3溶液(12gNaCl+2gH3BO3定容至100ml)和0.1ml蒸餾水,在B試管中加0.2ml甘露糖溶液和0.3ml蒸餾水。然后各加入濃H2SO44.5ml輕輕搖勻,立刻置入70℃水浴中,準(zhǔn)確計(jì)時(shí)25min,取出自來(lái)水冷卻至室溫。以蒸餾水為空白,在280nm處測(cè)得吸光值ODA、ODB。二者之差為△OD。以△OD值對(duì)甘露糖含量(μg/ml)作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0049X+0.0048,R2=0.9994。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量測(cè)定吸取樣品溶液0.2ml(相當(dāng)于20μg左右的多糖)按上述步驟測(cè)光密度,求得△OD值,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘露糖含量。2結(jié)果與討論2.1氧化蘇氏原螯蝦3-2-呋喃醛的紫外掃描糖的脫水反應(yīng)與酸度、溫度、時(shí)間以及某些試劑(如氯化鈉和硼酸)有關(guān)。在濃H2SO4溶液中已糖脫水生成羥甲基-2-呋喃醛,戊糖脫水主要產(chǎn)物是2-呋喃醛。呋喃醛具有共軛雙鍵,可產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收。甘露糖脫水產(chǎn)物在319nm處產(chǎn)生最大吸收,當(dāng)在NaCl-H3BO3存在的情況下,部分5-羥甲基-2-呋喃醛轉(zhuǎn)化為5-氯甲基-2-呋喃醛(硼酸對(duì)這種轉(zhuǎn)化有協(xié)調(diào)作用),由于氯原子的電負(fù)性大于羥基,導(dǎo)致共軛雙鍵的紫外吸收向低波長(zhǎng)位移,即5-氯甲基-2-呋喃醛在278nm產(chǎn)生最大紫外吸收。5-羥甲基-2-呋喃醛轉(zhuǎn)化為5-氯甲基-2-呋喃醛的量與甘露糖的量呈線性相關(guān)。因此根據(jù)前后兩次的吸光值之差,就可求出甘露糖的含量。由于各種已糖結(jié)構(gòu)上的差異,其脫水的速度也不同,甘露糖脫水速度快,而葡萄糖最難脫水。原因是葡萄糖呋喃環(huán)上C-2、C-3的羥基為反式結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證明在相同條件下,葡萄糖在278nm不產(chǎn)生最大吸收,因此控制脫水條件即可測(cè)定甘露糖在混合糖溶液中的含量。甘露糖、葡萄糖、果糖、木糖和半乳糖加與不加NaCl-H3BO3的紫外掃描圖如下。從圖1可以看出,甘露糖加NaCl-H3BO3脫水產(chǎn)物在278nm處有最大吸收峰。其它單糖則沒(méi)有,并且脫水產(chǎn)物在278nm處的紫外吸收不受NaCl-H3BO3的影響。2.2測(cè)量條件的確定2.2.1酸和光的吸收值的影響從圖2可以看出,隨著酸度的提高,△OD值逐步增加,當(dāng)酸度達(dá)到90%時(shí),△OD值達(dá)最大,再提高酸度△OD減小。2.2.2溫度對(duì)od值的影響圖3表明隨著溫度的升高,△OD值也逐步升高,當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)△OD值達(dá)到最大,然后呈下降趨勢(shì)。2.2.3時(shí)間對(duì)old值的影響圖4表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng),△OD值也逐步升高,當(dāng)加熱至25min時(shí)△OD值達(dá)到最大,然后呈下降趨勢(shì)。2.2.4比色符合測(cè)量結(jié)果從圖5-1和圖5-2可以看出反應(yīng)物是比較穩(wěn)定的。因此,在30min內(nèi)比色完畢不影響測(cè)量結(jié)果。通過(guò)以上研究,測(cè)定條件確定為:酸度90%、溫度70℃、時(shí)間25min,測(cè)定時(shí)間在30min內(nèi)完成。3干擾試驗(yàn)啤酒酵母樣品中可能對(duì)甘露糖測(cè)定產(chǎn)生干擾的因素有:葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、核苷酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等。3.1測(cè)定條件下的od甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和木糖的濃度各為100μg/ml,在相同條件下分別測(cè)定△OD值。表1可以說(shuō)明各種單糖對(duì)甘露糖測(cè)定結(jié)果的影響大小為:半乳糖>果糖>木糖>葡萄糖。從表2可以看出,當(dāng)甘露糖在混合溶液中的含量大于10%時(shí),測(cè)定誤差為正,即測(cè)定結(jié)果高于實(shí)際含量,反之則低于實(shí)際含量。3.2由于紫外吸收的aa對(duì)iiod的影響具有紫外吸收的AA有:Phe、Try、Tyr。AA的濃度為200μg/ml3.3糖和糖的影響RNA的濃度:100μg/ml。3.4he、tra、tyr濃度甘露糖濃度100μg/ml、RNA濃度為10μg/ml,Phe、Try、Tyr濃度均為20μg/ml。由表5可知,甘露糖在RNA、Phe、Try、Tyr混合液中的檢出率高于實(shí)際含量,即RNA、Phe、Tyr、Try對(duì)甘露糖的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生正的影響。4準(zhǔn)確度和精度的驗(yàn)證4.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回收試驗(yàn)的結(jié)果由表6可知,平均回收率為(100.42±3.6)%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.24%,這說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度比較高。4.2歸曲線上的加量由表7可知,兩曲線非常接近,兩條回歸曲線幾乎重疊。因此可知本方法已經(jīng)扣除本底,不存在基本干擾,可以直接使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定甘露糖,結(jié)果可靠。5最低檢出限的確定按△OD值以0.01為準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn),本法的最低檢出濃度為1.06μg/ml,即最低檢出限為1.06μg/ml。當(dāng)△OD值為0.3時(shí),甘露糖濃度為60.24μg/ml,即甘露糖濃度大約為60μg/ml時(shí)就可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量。6兩種方法對(duì)于母、魔芋精粉和醚爾豆膠中露天氣含量的影響高效液相色譜法與紫外分光法比較測(cè)定啤酒酵母、魔芋精粉和胍爾豆膠中甘露糖含量,其結(jié)果見(jiàn)表8。將兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(t檢驗(yàn))無(wú)顯著差異。這說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。7紫外分光法測(cè)定啤酒酵母中的露天成分的結(jié)果—討論本文通過(guò)研究甘露糖脫水的條件建立了紫外分光法測(cè)定甘露糖的方法。由于酸度、溫度和時(shí)間等操作條件易于控制,因此該方法具有廣泛的適用性。通過(guò)研究各種可能的干擾因素表明:葡萄糖、半乳糖、果糖和木糖盡管在280nm附近不產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收峰值,但也有一定的紫外吸收值,但對(duì)測(cè)定結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生較大的干擾。根據(jù)樣品中各種單糖的比例和大致含量,通過(guò)降低待測(cè)樣品的濃度即可降低其它己糖的影響。RNA、Phe、Try、Tyr在280nm附近可產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收,但由于以△OD值來(lái)計(jì)算甘露糖的含量,測(cè)量中產(chǎn)生紫外吸收的各種干擾因素就因前后兩次吸光值相減而被消除。通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法與標(biāo)準(zhǔn)加入法的對(duì)比試驗(yàn),對(duì)該方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行分析,結(jié)果表明,回收率是(100.42±3.64)%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.24%,小于5%。這表明該方法具有較高的精確度和準(zhǔn)確度。使用該方法測(cè)定啤酒酵母、魔芋精粉以及胍爾豆膠中甘露糖的含量與HPLC測(cè)定結(jié)果相比,前者偏高,但二者不存在顯著差異。這也進(jìn)一步證明,該方法是準(zhǔn)確可靠的。經(jīng)上述分析表明,利用紫外分光法測(cè)定啤酒酵母中的甘露糖是成功的。該方法符合分析方法的要求。8方法的優(yōu)越性(1)紫外分光法定量酵母中甘露糖