第二章基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應用課件

第二章 基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應用1第一節(jié) 基因工程基礎2一、基因工程的定義、基本操作程序（一）基因工程的定義基因（gene）DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質最小功能單位?；蚪M（geneome）一個生物體的全部基因序列。3.基因表達（gene

expression）遺傳信息轉錄和翻譯的過程。轉錄。在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相

對應的RNA的過程。翻譯。在RNA的控制下，根據(jù)核苷酸鏈上每三

個核苷酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質肽鏈過程。逆轉錄。以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順

序合成DNA的過程。3重組DNA技術（recombinant

DNA

technique）利用限制性內切核酸酶、連接酶等酶類將不同的DNA進行體外切割、連接構成新的DNA分子的技術?；蚬こ蹋╣ene

engineering）運用限制性內切核酸酶、連接酶等酶類將不同DNA進

行體外切割、連接構成重組DNA，再將重組DNA經生物介導或直接導入等轉移方法引入受體細胞進行克隆、表達，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質，或通過大量擴增為人類提供有用產品等的技術。食品基因工程利用基因工程的技術和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質，以改良食品的品質和性狀，提高食品的營養(yǎng)價值、貯藏價格性狀以及感官性狀的技術。45（二）基因工程的基本操作程序運用合適的方法從生物體中分離或通過化學合成制備目的基因。采用合適的方法將目的基因與合適的載體進行體外連接，構建重組DNA。利用合適的方法將重組DNA導入受體生物細胞以獲得轉化體。采用合適的方法篩選出重組轉化體陽性克隆。運用合適的方法對重組轉化體陽性克隆進一步分析以及操作，使目的基因在受體生物細胞中高效表達。6（三）基因工程的三大理論和三大技術基礎三大理論基礎（1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的轉化試驗證明

了生物的遺傳物質是DNA。（2）1950年代Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺

旋結構及DNA半保留復制機理。（3）1960年代Crick關于遺傳中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNA→RNA→蛋白質方向進行傳遞。三大技術基礎如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來（限制性內切核酸酶）。如何將獲得的基因片段進行連接（DNA連接酶）。如何將切割下來的基因片段進行繁殖擴增（基因載體）。7二、基因工程的工具酶8工具酶：基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、連接酶等）作為工具來對基因進行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶。（一）限制性內切核酸酶與DNA甲基化酶1.限制作用與修飾作用限制作用（restriction）：指一定類型的細菌可以

通過其限制性內切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源

DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的現(xiàn)象。修飾作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用

下，生物體自身DNA分子在特定堿基的特定位置上發(fā)生甲基化而得到修飾，從而免遭自身限制性內切核酸酶降解的現(xiàn)象。92.限制性內切核酸酶與DNA甲基化酶限制性內切核酸酶（restriction

endonuclease）：簡稱限制酶，指一類能夠識別和切割雙鏈DNA分子內核苷酸序列的內切核酸酶。DNA甲基化酶（DNA methylase）：簡稱甲基化酶，指一類能夠識別DNA特定序列，并在其特定堿基的特定位置上引入甲基而發(fā)生修飾作用的酶。103.限制性內切核酸酶的類型（

1

）

Ⅰ

型

。由三種不同亞基組成；輔助因子為

ATP112+Mg

及

S- 腺苷甲硫氨酸；切割位點距其000bp；切割作用隨機。Ⅰ型限制酶不宜作為基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型。由兩個相同亞基組成；輔助因子僅為Mg2+；識別位點常具旋轉對稱性；切割位點與其識別位點重疊或

在其附近；切割作用特異性強。

Ⅱ

型限制酶是基因工程理

想的工具酶。（

3

）

Ⅲ

型

。由兩種不同亞基組成；輔助因子為ATP

和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位點一

般在距其識別位點

3’

端

24～26bp

處。

Ⅲ型限制酶在基因工程中也不常用。限制性內切核酸酶沒有種屬特異性

，即限制性內切核酸酶識別、切割特定序列的能力同底物DNA的來源無關，它可識別、切割各種來源的DNA。DNA甲基化酶具有種屬特異性，生物體的DNA甲基化

酶只修飾保護自己的DNA，而不修飾保護非己的DNA。生物體的限制性內切核酸酶不能降解自身被修飾保護的DNA，而只能降解外源的DNA。12表4-1 限制性內切核酸酶的類型及主要特性主要特性13酶蛋白構成Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型三種不同亞基 兩個相同亞基 兩種不同亞基酶活輔助因子ATP、Mg2+及S-腺苷甲

硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+識別序列特性EcoBⅠ:TGAN8TGCT6EcoKⅠ:AACN6GTGC旋轉對稱EcoPⅠ:AGACCEcoP15

Ⅰ:CAGCAG切割位點距其特異識別位點至少1000bp處隨機切割在特異切割位點上或其附近特異切割距其識別位點3’端24～26bp處

特異切割4.Ⅱ型限制性內切核酸酶的切割方式在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成雙鏈平齊末端。在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側同時從3’端切斷磷酸二酯鍵，形成3’-羥基端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端。在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側同時從5’端切斷磷酸二酯鍵，形成5’-磷酸端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端。14155.影響限制性核酸內切酶活性的主要因素底物DNA制備物的純度蛋白質、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。底物DNA的甲基化程度dam甲基化酶：特異地 化DNA分子中5’GATC3’序列中的腺嘌呤N7位置的甲基化。dcm甲基化酶： 化DNA分子中5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位置的甲基化。16底物DNA的結構構型環(huán)狀雙螺旋DNA

較線性DNA

穩(wěn)定。在用限制酶酶解同樣

分子質量的DNA時，環(huán)狀雙螺旋DNA所需酶量為線性DNA所需酶量的10～20倍。酶反應緩沖液的組成酶反應體系中常含MgCl2、NaCl或KCl、三羥甲基氨基

甲烷（Tris）-HCl、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）等。Tris-HCl的作用在于使反應液的

pH值穩(wěn)定于酶活性所要求的最佳范圍內，而后三者均有穩(wěn)定酶的作用。17（5）酶反應的最適溫度大多數(shù)限制酶反應的最適溫度為37℃，少數(shù)限制酶反應的最適溫度高于或低于此溫度。反應溫度高于或低于其最適溫度，酶的活力均會下降。應根據(jù)各限制酶反應的最適溫度作相應調整。186.限制酶的主要用途在特異位點上切割DNA，產生特異的限制酶切割的

DNA片段。建立DNA分子的限制酶圖譜。限制酶圖譜（restriction map）:指一系列限制酶的特

異識別序列在DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對位置。構建基因文庫。基因工程中，將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料，稱為基因文庫（genelibrary）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。192021（二）DNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大腸桿菌DNA聚合酶

Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐熱的DNA聚合酶（Taq

DNA聚合酶）等。依賴于RNA的DNA聚合酶（即逆轉錄酶）優(yōu)先以RNA為模板，也可以DNA為模板。逆轉錄酶能以RNA為模板 化合成雙鏈DNA。末端脫氧核苷酸轉移酶（簡稱末端轉移酶）不以DNA或RNA為模板，而只是將核苷酸加到已有DNA分子的末端。22DNA聚合酶作用的條件要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體化合成DNA，接受模板指導，產物的性質與模板編碼相同。不能起始合成新的DNA鏈，要有引物3’-羥基

的存在?；痙NTP加到生長中的DNA鏈的3’-羥基末端。化DNA合成的方向是5’→3’

。231.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）一種從大腸桿菌中分離出的一條分子質量為

109KDa

的多肽鏈（球蛋白）。具有三種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈

DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物；②5’→3’外切核酸酶活性，從5’端既降解雙鏈DNA，也降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈

DNA或單鏈DNA。主要用于：①以切刻平移法標記DNA；②對DNA分子的

3’突出尾進行末端標記。24252.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）一條分子質量為76KDa的多肽鏈，一般由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶經枯草桿菌蛋白酶水解獲得，也可通過克隆技術獲得。具有兩種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈

DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。②3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙

鏈DNA或單鏈DNA。26273.Taq DNA聚合酶最初來源于水生棲熱菌（

Thermus

aquaticus），現(xiàn)

可由基因工程途徑來生產。分子質量為65KDa，是一種非常耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。具有一種活性

：

5’→3’DNA

聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。主要用于：①對DNA進行測序。②通過聚合酶鏈式反應（polymerase

chain

reaction，PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增。284.逆轉錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）常用的逆轉錄酶有兩種

：一種來自禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條多肽鏈組成，分子質量為170KDa。一種來自鼠白血病病毒（MLV）逆轉錄酶基因的大腸桿菌，由單鏈多肽組成，分子質量為84KDa。具有兩種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA

或者DNA為模板，以帶3’自由羥基的RNA或DNA片段為引物。②RNA酶H活性，即5’→3’ 外切核糖核酸酶活性，特異地降解RNA-DNA雜交體中的RNA。逆轉錄酶無3’→5’外切核酸酶活性，即無校對功能，其催化的聚合反應容易出錯。29305.末端脫氧核苷酸轉移酶（末端轉移酶）來源于小牛胸腺，分子質量為

60KDa

，是一種不需要模板的特殊的DNA聚合酶。具有一種活性：即末端轉移酶活性，在二價陽離子存

在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羥基端。主要用于：①給載體DNA或cDNA加上互補的同聚尾。②以32P標記的一種dNTP或一種rNTP來標記DNA片段的3’端。31（三）連接酶、磷酸酶321.T4噬菌體DNA連接酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，分子質量為68KDa。具有一種活性：即催化DNA

的5’

磷酸基與3’

羥基之

間形成磷酸二酯鍵。該酶的核酸底物為黏性末端DNA、平齊末端DNA等。主要用于：①連接帶匹配黏性末端的DNA分子。②使平齊末端的雙鏈DNA分子互相連接或與合成接頭相連接。2.堿性磷酸酶來源于大腸桿菌及牛小腸。包括

細菌堿性磷酸酶

（bacterial

alkaline phosphatase

，

BAP

）和

牛小腸堿性

磷酸酶（calf

intestinal

alkaline phosphatase，CIP）。具磷酸酶活性，催化去除5’

磷酸的反應。底物為單鏈或雙鏈DNA及RNA、dNTP。主要用于：①在用32P標記5’末端前，去除DNA或RNA

分子的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸，以防自身環(huán)化。33三、基因工程的載體34載體（vector）：攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具?；蚬こ梯d體的特性:能在宿主細胞內進行獨立和穩(wěn)定的DNA自我復制。在插入外源基因后，仍然保持著穩(wěn)定的復制狀態(tài)和遺傳特性。易于從宿主細胞中分離，并進行純化。DNA序列中有適當?shù)南拗菩詢惹忻肝稽c，最好是單一酶切位點，并位于DNA復制的非必需區(qū)內，可以在這些位點上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復制。具有能夠觀察到的表型特征，在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇的標志。載體的報告基因（標記基因）：基因工程中利用載體上引入的一些具有特殊標志意義的基因，可用來證明載體

已經進入宿主細胞，并可用來將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑選出來，這種具有標志意義的基因稱為報告基因（reportergene）或標記基因。最常用的報告基因有抗藥性基因（例如，抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素等抗生素抗性基因）， 此外，還有氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT基因）、 β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、β-球蛋白基因和人生長激素基因等。35按照介導的作用目的，可將基因工程載體主要分為克隆載體和表達載體?？寺≥d體：有一個松弛性復制系統(tǒng)，能使外源DNA在受體生物細胞中擴增復制。（例如，細菌質粒載體、λ噬菌體載體、柯氏質粒載體）表達載體：有一個受體生物細胞所要求的包括啟動子序列在內的調控系統(tǒng)，能使外源基因在受體生物細胞中進行功能表達。（例如，Ti質粒、SV40猴狀病毒）按照導入的受體生物，一般可將基因工程載體分為大腸

桿菌（原核細胞）載體

、

酵母載體

、植物載體、動物載體等。36（一）大腸桿菌載體1.質粒載體質粒

:

指細菌等生物細胞內一類獨立于染色體外而能

自我復制的遺傳物質。質?？截悢?shù)（

plasmidcopynumber）：一種質粒在一個細胞中存在的數(shù)目。37（1）質粒的生物學特性一般為雙鏈的共價閉合環(huán)狀DNA（ccc DNA），質粒

分子的長度一般為1～200 kb。不同質粒的分子質量差異顯著，小質粒的分子質量約為103KDa，僅能編碼2～3種中等大小的蛋白質；而大質粒的分子質量可達105KDa。38（2）質粒的分類根據(jù)復制控制類型：一般可將大腸桿菌質粒分為嚴緊型復制控制質粒和松弛型復制控制質粒。嚴緊型復制控制質粒:復制與宿主染色體的復制同步，并與宿主蛋白質的合成有關，而與DNA聚合酶Ⅰ的活性無關。如果宿主蛋白質的合成終止，質粒與宿主染色體的復制也停止。每個宿主細胞中只能達到1至數(shù)個拷貝。松弛型復制控制質粒:復制與宿主染色體的復制不同步，

其與DNA聚合酶Ⅰ的活性有關，而與蛋白質的合成無關。當宿主蛋白質的合成終止時，質粒仍可復制。每個宿主細胞中的質粒拷貝數(shù)可達10～200個。39（3）質粒克隆載體的條件①分子結構中具有多個單一限制酶切位點，具有易被

檢測的選擇標記基因，且切點位于選擇標記基因上。②能插入、運載一定大小的外源基因。③在攜帶外源基因前后在宿主細胞內均能自主復制。④在與外源基因構建重組質粒后具有轉化功能。⑤分子質量小，易于操作，一般為松弛型復制控制。⑥容易控制，安全可靠?，F(xiàn)已通過DNA重組技術構建了許多質粒克隆載體供基

因工程應用，例如，pBR322、pUC系列等。4041（4）質粒pBR322組成①氨芐青霉素抗性基因（ampr）②四環(huán)素抗性基因（tetr）③DNA復制起始點（ori）優(yōu)點①分子質量小。②具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇標記。③較高的拷貝數(shù)。4243（5）pUC質粒載體組成① 來自pBR322的復制起始點（ori）②大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及

其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ’基因。③氨芐青霉素抗性基因（ampr），但其核苷酸序列有變化，不含原來內切限制酶的單位識別位點。④位于lacZ’基因中的靠近5’端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)，但它并不破壞該基因的功能。優(yōu)點①更小的分子質量和更高的拷貝數(shù)。②適用于組織化學方法檢測重組體。③有多克隆區(qū)位點。44452.噬菌體載體（1）噬菌體的生物學特性不同種類的噬菌體（顆粒）在外形上差別很大。大多數(shù)噬菌體顆粒由呈20面體的頭部及尾部構成，例如，λ噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形，例如，M13。在結構上，噬菌體顆粒比質粒復雜。噬菌體顆粒的外殼是蛋白質，內部是核酸。該核酸最常見的構型是線狀雙鏈DNA，此外，還有環(huán)狀雙鏈DNA、線狀單鏈DNA、環(huán)狀單鏈DNA等。4647（2）λ噬菌體載體λ噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。頭部裝載了其整

個基因組λDNA。λDNA為一長度約48.5 kb的線狀雙鏈DNA分子，可以分為三個區(qū)段：左臂、中央?yún)^(qū)和右臂。在左臂和右臂的5’處各有12個堿基長的互補單鏈（從而構成黏性末端）。

當λ噬菌體感染宿主細胞時，λDNA被注入宿主細胞后會迅速通過黏性末端的互補作用形成環(huán)狀雙鏈DNA分子。48λ噬菌體載體的優(yōu)點：①可攜帶較長的外源DNA片段。②重組后的DNA分子可在體外被包裝成噬菌體顆粒。③重

組的噬菌體容易篩選和貯存。λ噬菌體的必要基因：λDNA至少包括61個基因。其中大約半數(shù)基因參與噬菌體生命周期活動，位于其左臂

和右臂，這類基因稱作λ噬菌體的必要基因。*

噬菌體的非必要基因：

另一部分基因在被外源基

因取代后并不影響噬菌體的生命周期活動，位于其中央?yún)^(qū)，這類基因稱作λ噬菌體的非必要基因。cos位點（cohesive-end site）：由黏性末端結合

形成的雙鏈區(qū)段。49*

噬菌體載體的分類：根據(jù)插入方式，一般可將λ

噬菌體載體分為插入型載體和置換型載體。插入型載體（insertionvector）：指在基因組的

非必要基因區(qū)內有一種或不止一種限制酶的單一酶切位點可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的λ噬菌體載體。由插入型載體得到的重組DNA分子都比原載體長。插入型載體可容納的外源DNA片段相對較小，一般在10 kb以內。廣泛應用于cDNA以及小片段DNA的克隆。50置換型（取代型）載體（

replacement

vector

）：指在基因組的非必要基因區(qū)內兩個或兩個以上的限制酶切位點間的DNA區(qū)段可被插入的外源DNA片段所置換的λ噬菌體載體。置換型載體容納外源DNA

片段大小的范圍一般在

9

～

22kb之間。有些λ噬菌體載體兼有插入和置換兩種外源DNA片段的

插入方式，這具體取決于載體與外源DNA末端匹配的限制酶切位點的種類和數(shù)目等。51523.柯斯質粒載體（Cosmidvector）也稱黏粒載體，指一類由人工構建的含有抗性基因、單一克隆位點、λDNA的cos位點和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。分子質量較小，一般為4～6kb。（1）柯斯質粒載體的組成①1個質粒復制起始區(qū)域復制子（基因組中能獨立進

行復制的單位）；②至少1個抗藥性選擇標記基因；③至少1個限制酶的單一識別切割位點；④1個λ噬菌體黏性末端片段cos位點。53（2）柯斯質粒載體的特點①具有質粒載體的特性：它帶有質粒的復制子，能像

質粒DNA一樣在宿主細胞內復制，也能在氯霉素的作用下進行擴增。帶有抗生素抗性基因，有些還帶有基因插入失活的克隆位點，為重組體的篩選提供了簡便的標記。②具有λ噬菌體載體的特性：它在與適宜長度的外源

DNA片段重組后，可在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效

地轉入對λ噬菌體敏感的大腸桿菌宿主細胞。進入宿主細胞后，也能像λ噬菌體一樣進行環(huán)化。③具有高容量的克隆能力：質粒載體的克隆容量一般為10

kb，λ噬菌體載體的克隆容量理論極限值是23

kb，一般為15

kb左右，而柯斯質粒載體的克隆極限可達45

kb左右。5455（一）基本原理在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用DNA聚合酶化合成反應，體外擴增特異DNA片段。在進行PCR擴增時，通常需要設計合成一對與目的DNA片段兩側翼序列分別互補的寡核苷酸引物。其中一引物與目的區(qū)段上游一條模板鏈的序列相互補，而另一引物與目的區(qū)段下游另一條模板鏈的序列相互補。56四、多聚酶鏈式反應（PCR）技術將熱變性后分開的兩條模板鏈與摩爾數(shù)大大過量的兩個引物共同溫育復性產生的模板－引物雜交體作為作

用底物，利用耐熱的Taq DNA聚合酶 化延伸合成反應。在第一輪擴增完畢后，將反應混合物再加熱使新構成的雙鏈DNA變性，然后再度溫育使模板鏈與引物復性，進入第二輪特異性合成。由于耐熱的Taq DNA聚合酶在熱變性步驟中不失活，可直接進入第二輪特異性合成而不需要另外補加DNA聚合酶等。57PCR的每個循環(huán)包括3步變性（denaturation）。通過加熱至一定溫度使雙鏈DNA兩鏈間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈離解形成兩條DNA單鏈。復性（退火，annealling）。當反應體系溫度突然降低時，由于模板DNA分子的結構比引物DNA分子復雜得多，而且在反應體系中引物的量大大多于模板，因此引物和與其互補的模板配對形成局部雜交雙鏈，而變性后離解形成的兩條模板DNA單鏈之間互補配對的機會則較少。延伸（extension）。在4種脫氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的條件下，TaqDNA聚合酶以模板－引物雜交體分別為模板和引物化DNA鏈沿5’→3’方向合成延伸。每個循環(huán)的擴增產物作為下一循環(huán)的模板。58592.PCR的操作體系和反應條件（

1

）模板。待測的核苷酸（

DNA

或

RNA

）分子；雙鏈

DNA可直接用于反應，而RNA則需要用反轉錄酶反轉錄成為

cDNA，然后用作聚合酶反應的模板。（2）DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4

DNA

聚合酶

化。由于每輪反應需要三個溫度點，因此采用耐熱TaqDNA聚合酶。（

3

）一對引物。根據(jù)已知DNA

序列，由人工合成的與

所要求擴增的DNA兩端臨近序列互補的寡核苷酸片段，即左右端引物。（

4

）四種三磷酸脫氧核苷（即dNTP

），是合成DNA

所

需的原料。適當?shù)木彌_液體系。反應條件。94℃變性30s；55℃復性30s；70～72℃延伸30～60s。一共進行30輪左右的循環(huán)。60第二節(jié) 基因工程研究61一、目的基因的制備外源基因：插入到載體內的非自身的DNA片段。目的基因

：又稱為靶基因，是根據(jù)基因工程的目的和設計所需要的某些DNA分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼。已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列，基因的制備方法主要分為兩大類：一類是基因化學合成法，一類是基因生物制備法。一般又可將基因生物制備法分為基因組文庫法、cDNA文庫法和PCR法等。（一）基因化學合成法DNA的化學合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸酰胺法及固相亞磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初發(fā)明的化學合成基因的方法，而固相亞磷酸酰胺法是目前絕大部分DNA自動合成儀所使用的方法?；虻幕瘜W合成法主要用于PCR擴增引物、核酸測序引物、核酸雜交探針和合成接頭等寡核苷酸片段的合成。（二）基因組文庫法是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。62636465（三）cDNA文庫法指匯集以某種生物體成熟mRNA為模板逆轉錄而成的

cDNA序列的重組DNA群體。在基因工程中，cDNA文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。（四）PCR法一般經典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特異擴增；而一些改進的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特異擴增。66二、目的基因與載體的重組（重組體的構建）67基因重組（gene

recombination）：利用限制性內切

酶和其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因，并將兩者連接起來。目的基因和載體的連接分為黏性末端連接、平末端連

接、人工接頭連接和同聚物加尾連接。（一）黏性末端連接1.同一限制酶切位點連接由同一限制酶切割的不同DNA片段具有相同的末端，

當這樣的兩個DNA片段一起退火時，黏性末端單鏈間進行堿基配對，然后在T4DNA連接酶催化作用下形成共價結合的重組DNA分子。68692.雙酶切片段的定向克隆以兩種不同的限制酶切割目的基因，使之產生兩個

不同黏端，對載體同樣以這兩個限制酶切割，達到載體

DNA和外源DNA片段自身兩端為非同源的黏端，此時載體和外源DNA片段都不會發(fā)生自身環(huán)化，而且只有在DNA連接酶的作用下，載體DNA和外源DNA片段以兩端互補實現(xiàn)

DNA定向插入。優(yōu)點：（

1

）外源DNA

只能以一個方向插入到重組質粒，以

便目的基因的正確轉錄和表達。（2）由于不會自身環(huán)化，轉化率高，轉化后的細菌克隆大多數(shù)是攜帶有目的基因的重組質粒。70713.不同限制酶切位點連接配伍末端

（

compatible

end

）：由兩種不同的限制酶切割的DNA片段、具有相同類型的黏性末端。同尾酶

（

isocaudamers

）

:

來源不同，能夠對DNA

切割產生相同的黏性末端，而其識別序列的特異性不同。同尾切割可以產生完全配伍（互補）的黏性末端

，便于兩個DNA片段的連接。同裂酶（

isoschizomers）：來源不同，具有相同識別序列，但切點不同。經過同裂酶切割過的DNA與載體連接前可能還必須進行前處理。72平端連接具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。在一定的反應條件下，可用T4DNA連接酶將平齊末端的DNA片段有效地連接起來。人工接頭連接人工接頭：人工合成的具有特定限制性內切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內切酶位點，應用相應的內切酶切割，就可以分別得到互補的黏性末端。73744.同聚物加尾連接利用同聚物序列之間的退火作用完成連接。末端轉移酶在DNA片段的3’末端添加同聚尾造成延伸部分。末

端轉移酶不具有特異性，在4種dNTP中任何一種均可作為前體物，可以產生由單一核苷酸所構成的3’同聚物末端。7576三、將重組體導入受體細胞（重組轉化體的獲得）77轉化（transformation）：將重組質粒導入受體細胞，使受體菌遺傳性狀發(fā)生改變的方法。轉染（transfection）:將攜帶外源基因的病毒感染受體細胞的方法。根據(jù)受體生物，一般可將重組體導入受體細胞的方法主要分為大腸桿菌轉化法、酵母轉化法、植物細胞轉化法和動物細胞轉化法。1.氯化鈣轉化法78首先將對數(shù)生長期的大腸桿菌懸浮于冰預冷的低滲

氯化鈣溶液中處理，使細胞膜通透性增加，然后加入重組DNA，使DNA與鈣離子形成復合物，吸附于細胞表面，經42℃短暫的熱處理，促進外源DNA進入宿主細胞。2.轉染首先將重組的λ

噬菌體DNA

或柯斯質粒DNA

體外包裝成具有感染能力的λ噬菌體顆粒，然后經由在受體細胞表面的λ噬菌體接受器位點使這些重組體DNA注入大腸桿菌宿主細胞。四、重組轉化體的篩選和鑒定79（一）利用表型特征進行篩選（遺傳檢測法）表型：指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產生的外觀或其他特征。1.利用載體提供的表型特征進行篩選抗藥性標記基因插入失活篩選法β－半乳糖苷酶顯色反應篩選法。2.利用外源DNA提供的表型特征進行篩選要求外源

DNA

是一個完整的基因，而且能夠在大腸桿