分子生物學(xué)簡答題

課后思考題1.試述乳糖操縱子的構(gòu)造及調(diào)控原理？乳糖操縱子開放轉(zhuǎn)錄需要什么條件？（1）乳糖操縱子的構(gòu)造：含Z、Y、A3個(gè)構(gòu)造基因，分別編碼乳糖代謝的3個(gè)酶；一種操縱序列O，一種啟動(dòng)序列P，一種CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)。乳糖操縱子的上游尚有一種調(diào)節(jié)基因I。（2）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：I基因的體現(xiàn)產(chǎn)物為一種阻遏蛋白，在沒有乳糖存在時(shí)，阻遏蛋白與O序列結(jié)合，妨礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，克制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，乳糖操作子處在阻遏狀態(tài)；當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?，后者結(jié)合阻遏蛋白，使構(gòu)象變化，阻遏蛋白與O序列解離，在CAP蛋白協(xié)作下發(fā)生轉(zhuǎn)錄。（3）CAP的正性調(diào)節(jié)：分解代謝基因激活蛋白（CAP）分子內(nèi)存在DNA和cAMP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)沒有葡萄糖時(shí)，cAMP濃度較高，cAMP與CAP結(jié)合，cAMP-CAP結(jié)合于CAP結(jié)合位點(diǎn)，提高RNA轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)有葡萄糖時(shí)，cAMP濃度減少，cAMP與CAP結(jié)合受阻，乳糖操縱子體現(xiàn)下降。（4）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)和CAP的正性調(diào)節(jié)機(jī)制協(xié)調(diào)合作，CAP不能激活被阻遏蛋白封閉基因的體現(xiàn)，但如果沒有CAP存在來加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，即使阻遏蛋白從操縱序列上解離仍無轉(zhuǎn)錄活性。因此，乳糖操縱子開放轉(zhuǎn)錄需要的條件是：1）誘導(dǎo)物乳糖存在，解除阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)。2）葡萄糖缺少，CAP蛋白活化，啟動(dòng)正調(diào)節(jié)。2.試述原核生物和真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控特點(diǎn)的異同。（1）相似點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始是基因體現(xiàn)調(diào)控的核心環(huán)節(jié)。（2）不同點(diǎn)：1）原核生物基因體現(xiàn)調(diào)控重要涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；真核基因體現(xiàn)調(diào)控涉及染色質(zhì)活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工多個(gè)層次。2）原核基因體現(xiàn)調(diào)控重要為負(fù)調(diào)節(jié)；真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控重要為正調(diào)節(jié)。3）原核轉(zhuǎn)錄起始不需要轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶直接結(jié)合啟動(dòng)子，由σ因子決定基因體現(xiàn)的特異性；真核轉(zhuǎn)錄起始需要基礎(chǔ)、特異兩類轉(zhuǎn)錄因子，依賴DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活。4）原核基因體現(xiàn)調(diào)控重要采用操縱子模型，轉(zhuǎn)錄出多順反子RNA，實(shí)現(xiàn)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)；真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子RNA，功效有關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)體現(xiàn)機(jī)制更為復(fù)雜。4.簡述真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控的特點(diǎn)。（1）真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控重要為正調(diào)節(jié)。（2）真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子RNA，功效有關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)體現(xiàn)機(jī)制更為復(fù)雜。（3）真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控含有典型的多級(jí)調(diào)控特點(diǎn)，涉及染色質(zhì)水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控等。（4）與基本調(diào)控點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄起始親密有關(guān)的是染色質(zhì)水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。染色質(zhì)水平的調(diào)控是真核基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的前提，染色質(zhì)核小體中組蛋白的不同化學(xué)修飾組合可形成組蛋白密碼，通過參加調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑，變化染色質(zhì)活性，DNA甲基化修飾普通克制基因的轉(zhuǎn)錄活性。（5）轉(zhuǎn)錄起始是真核生物基因體現(xiàn)調(diào)控的最重要環(huán)節(jié)。真核生物RNA聚合酶對啟動(dòng)子的親和力極小，必須依賴一種或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用才干起始轉(zhuǎn)錄。調(diào)控作用重要是通過反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，影響RNA聚合酶的作用。順式作用元件是調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列，涉及啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等，反式作用因子是能與序列特異DNA結(jié)合的蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子，重要功效是使基因開放和關(guān)閉，從而影響轉(zhuǎn)錄。（6）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控涉及對mRNA的加工修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞質(zhì)定位以及穩(wěn)定性等多方面的調(diào)控。翻譯調(diào)控點(diǎn)重要在起始階段和延長階段，翻譯起始因子的磷酸化可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯。另外，小分子RNA通過干擾翻譯過程克制基因體現(xiàn)。真核基因體現(xiàn)調(diào)控特點(diǎn)：1）現(xiàn)有瞬時(shí)調(diào)控，又有發(fā)育調(diào)控2）調(diào)控環(huán)節(jié)更多3）染色質(zhì)構(gòu)造變化影響轉(zhuǎn)錄效率4）轉(zhuǎn)錄調(diào)控以正調(diào)控為主5）調(diào)控元件復(fù)雜并且能夠遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄區(qū)6）轉(zhuǎn)錄因子種類多，調(diào)控機(jī)制更復(fù)雜真核生物和原核生物基因構(gòu)造的差別：1）原核生物的構(gòu)造基因是持續(xù)的，RNA合成后不需要剪接加工；由外顯子（編碼序列)和內(nèi)含子（非編碼序列)兩部分構(gòu)成，編碼序列不持續(xù)，稱為斷裂基因2）真核生物的基因都是單順反子；原核生物大多是多順反子真核生物、原核生物、病毒基因組特點(diǎn)差別：1）病毒：①所含核酸的種類與構(gòu)造不同②所含核酸的分子數(shù)不同③基因組?、芑蚪M為單倍體并且所含基由于單拷貝⑤基因組序列基本上都是編碼序列⑥基因的持續(xù)性不同⑦有關(guān)基因串連成一種轉(zhuǎn)錄單位2）原核：①基因組DNA大多數(shù)為超螺旋構(gòu)造的單一閉合雙鏈分子②基因組DNA只有一種復(fù)制起點(diǎn)③基因組序列以編碼序列為主④基因組所含基因的數(shù)目比病毒多3）真核：①染色體DNA是線性分子②染色體DNA形成染色體構(gòu)造③基因組序列中僅有不到10%是蛋白質(zhì)編碼序列④基因在基因組中散在分布⑤基因組序列中包含大量重復(fù)序列⑥基因組中存在多個(gè)基因家族⑦基因組中含大量轉(zhuǎn)座子3.什么是誘導(dǎo)和阻遏？以乳糖和色氨酸操縱子為例，比較兩種操縱子的構(gòu)造及負(fù)調(diào)控方式的差別。在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，對應(yīng)的基因被激活，基因體現(xiàn)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因?？烧T導(dǎo)基因在特定環(huán)境中體現(xiàn)增強(qiáng)的過程，稱為誘導(dǎo)。如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被克制，這種基因是可阻遏基因?？勺瓒艋蝮w現(xiàn)產(chǎn)物水平減少的過程稱為阻遏。乳糖和色氨酸操縱子相似之處：都是DNA序列，是轉(zhuǎn)錄的功效單位，由調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子、操縱基因和構(gòu)造基因構(gòu)成。不同之處：乳糖操縱子是負(fù)控控誘導(dǎo)，色氨酸操縱子是負(fù)調(diào)控阻遏。乳糖操縱子是一種可誘導(dǎo)的操縱子。乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因編碼阻遏蛋白，當(dāng)無乳糖存在時(shí)，阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，制止RNA聚合酶對構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)乳糖存在時(shí)，乳糖的分解產(chǎn)物半乳糖作為誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象變化，造成阻遏蛋白與操縱序列解離，誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。色氨酸操縱子重要受阻遏克制調(diào)控，在細(xì)胞內(nèi)無色氨酸時(shí)，阻遏蛋白不與操縱序列結(jié)合，轉(zhuǎn)錄開放；當(dāng)色氨酸濃度較高時(shí)，色氨酸與阻遏蛋白形成復(fù)合物并結(jié)合到操縱序列上，關(guān)閉基因體現(xiàn)。5.簡述胰高血糖素升血糖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（以PKA信號(hào)通路為例）。胰高血糖素升高血糖是由G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的。G蛋白偶聯(lián)受體由一條多肽鏈構(gòu)成，其肽鏈重復(fù)跨膜七次，膜內(nèi)部分與G蛋白偶聯(lián)。G蛋白是GTP結(jié)合蛋白，結(jié)合GTP時(shí)為活化形式，作用于下游分子，并開放對應(yīng)信號(hào)途徑；同時(shí)含有GTP酶活性，水解GTP為GDP時(shí)為非活化形式，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)閉。胰高血糖素和受體結(jié)合后激活G蛋白，使之構(gòu)象發(fā)生變化。α亞基與GDP的親和力下降，結(jié)合的GDP被GTP取代，結(jié)合了GTP的α亞基與βγ亞基解離，進(jìn)入活化狀態(tài)?；罨摩羴喕饔糜谙掠蔚男?yīng)分子，這種活化狀態(tài)將始終持續(xù)到GTP被α亞基本身水解為GDP，又再次與βγ亞基形成復(fù)合體，回到靜止?fàn)顟B(tài)?；罨摩羴喕鶎⑿盘?hào)傳遞給腺苷酸環(huán)化酶AC，使AC活化，催化ATP生成小分子信使cAMP，cAMP又激活蛋白激酶A（PKA），PKA激活糖原磷酸化酶b激酶，增進(jìn)糖原分解代謝；同時(shí)克制糖原合酶，克制糖原合成，從而使血糖升高。6.列舉G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。（1）cAMP-PKA通路。激素和受體結(jié)合后激活G蛋白，釋放GTP結(jié)合形式的活化的α亞基，α亞基激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）。AC催化產(chǎn)生小分子信使cAMP。cAMP結(jié)合PKA，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)作用激活PKA，PKA通過磷酸化作用激活或克制多個(gè)效應(yīng)蛋白，產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞效應(yīng)。（2）IP3/DAG-PKC通路。這類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的細(xì)胞外信號(hào)分子結(jié)合受體激活G蛋白，釋放活化的α亞基，α亞基激活PLC。PLC水解膜組分PIP2，生成DAG和IP3。IP3從膜上擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)上的受體結(jié)合，增進(jìn)這些鈣儲(chǔ)存庫內(nèi)的Ca2+快速釋放，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度升高。Ca2+與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PKC結(jié)合并聚集至質(zhì)膜。DAG生成后仍留在質(zhì)膜上，當(dāng)結(jié)合有Ca2+的PKC聚集到質(zhì)膜時(shí)，DAG、磷酯酰絲氨酸與Ca2+共同作用于PKC的調(diào)節(jié)構(gòu)造域，使PKC變構(gòu)而暴露出活性中心。PKC通過磷酸化作用激活多個(gè)功效蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝、基因體現(xiàn)等生理活動(dòng)。（3）Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白質(zhì)激酶通路。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高后，Ca2+可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，形成含有調(diào)節(jié)功效的Ca2+/CaM復(fù)合物。Ca2+/CaM復(fù)合物的下游信號(hào)分子為鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶。鈣調(diào)蛋白依賴性激酶屬于蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸激酶，如肌球蛋白輕鏈激酶、磷酸化酶激酶、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶。這些激酶可激活多個(gè)效應(yīng)蛋白質(zhì)，在收縮和運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)代謝、神經(jīng)遞質(zhì)的合成、細(xì)胞分泌和分裂等多個(gè)生理過程中發(fā)揮重要作用。7.簡述G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本模式。（1）細(xì)胞外信號(hào)分子結(jié)合受體，通過別構(gòu)效應(yīng)將其激活。（2）受體激活G蛋白，G蛋白在有活性和無活性狀態(tài)之間持續(xù)轉(zhuǎn)換，稱為G蛋白循環(huán)。（3）活化的G蛋白激活下游效應(yīng)分子。（4）G蛋白的效應(yīng)分子向下游傳遞信號(hào)的重要方式是催化產(chǎn)生小分子信使。（5）小分子信使作用于對應(yīng)的靶分子（重要是蛋白激酶），使之構(gòu)象變化而激活。（6）蛋白激酶通過磷酸化作用激活某些與代謝有關(guān)的酶、與基因體現(xiàn)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及某些與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白，從而產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞應(yīng)答反映。8.列舉第二信使分子的種類及其重要特點(diǎn)。第二信使分子的種類重要涉及環(huán)腺苷酸（cAMP）、環(huán)鳥甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）、Ca2+、NO等。重要特點(diǎn)：（1）為細(xì)胞內(nèi)含有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功效的小分子化合物。（2）在完整細(xì)胞中，該分子的濃度或分布在外源信號(hào)的作用下發(fā)生快速變化。（3）該分子類似物可模擬外源信號(hào)的作用。（4）阻斷該分子的變化可阻斷細(xì)胞對外源信號(hào)的反映。（5）該分子在細(xì)胞內(nèi)有擬定的靶分子。（6）可作為別位效應(yīng)劑作用于靶分子。（7）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要變化是濃度變化。PKA使絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化PKC屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶上游信號(hào)：腺苷酸環(huán)化酶鳥苷酸環(huán)化酶常見第二信使：cAMPcGMPIP3←脂類→DAGCa2+效應(yīng)蛋白：蛋白激酶APKGIP3門控鈣通道PKCPKC,鈣調(diào)蛋白激酶9.請比較PCR反映和體內(nèi)DNA復(fù)制過程的異同點(diǎn)。10.克隆載體普通含有哪些基本特性？（1）含有自主復(fù)制起點(diǎn)，使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，并能使克隆的外源DNA得到同時(shí)擴(kuò)增；（2）最少有一種篩選標(biāo)志；（3）有適宜的限制性核酸內(nèi)切酶單一酶切位點(diǎn)，可供外源基因插入時(shí)選擇。11.簡述分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的α互補(bǔ)和藍(lán)白斑篩選的原理。β-半乳糖苷酶（β-gal）的α片段與受體菌編碼的ω片段（lacZ-ω）能夠互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮β-gal的活性，稱作α互補(bǔ)。某些質(zhì)粒上帶有β-半乳糖苷酶α片段的編碼序列LacZ’，轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌，可形成α互補(bǔ)，即可催化底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使菌落變藍(lán)。由于這些質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)位于LacZ’內(nèi)部，插入外源DNA片段后，使LacZ’不能編碼產(chǎn)生有功效的β-gal的α片段，不能發(fā)生α互補(bǔ)，在X-gal存在下受體菌落呈白色。因此，藍(lán)色菌落代表載體中LacZ’基因活性完好無損，沒有插入外源DNA片段，白色菌落則表明著所含質(zhì)粒帶有外源DNA片段，為重組質(zhì)粒。用藍(lán)白斑篩選能夠來分辨轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌的是空載體還是重組質(zhì)粒。12.試述重組DNA技術(shù)的基本環(huán)節(jié)。（1）分：目的DNA的分離獲取；（2）選：載體的選擇與構(gòu)建；（3）接：目的DNA與載體連接；（4）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；（5）篩：重組體的篩選與鑒定。13.以鐮狀細(xì)胞貧血病為例簡述疾病發(fā)病分子機(jī)理，并介紹對其進(jìn)行PCR-RFLP基因診療的辦法。鐮狀細(xì)胞貧血是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病，屬于分子病。正常成人血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β鏈互相結(jié)合成的四聚體，α鏈和β鏈分別由141和146個(gè)氨基酸次序連構(gòu)造成。鐮狀細(xì)胞貧血患者因β珠蛋白基因（HBS）發(fā)生第6密碼子的錯(cuò)義突變（A變?yōu)門），使編碼生成的β鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所替代，形成了異常的血紅蛋白S（hemoglobinS，HbS），取代了正常血紅蛋白（HbA），在氧分壓下降時(shí)HbS分子間互相作用，成為溶解度很低的螺旋形多聚體，使紅細(xì)胞扭曲成鐮狀細(xì)胞（鐮變）造成貧血癥狀。HBS突變堿基位于限制性核酸內(nèi)切酶MstII位點(diǎn)（CC.TNAGG）中，突變（A變?yōu)門）造成該限制性酶切位點(diǎn)丟失，因此，能夠設(shè)計(jì)鐮狀細(xì)胞貧血的PCR-RFLP診療辦法：PCR擴(kuò)增HBB基因含第5/6/7密碼子的片段（1.35kb），用MstII充足消化擴(kuò)增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳分析。正常人擴(kuò)增產(chǎn)物顯示1.15kb和0.20kb兩條條帶，鐮狀細(xì)胞貧血患者擴(kuò)增產(chǎn)物則顯示1.35kb單一條帶，攜帶者則有1.35kb、1.15kb和0.20kb三條條帶。14.簡述基因治療的幾個(gè)方略和基本程序。基因治療的方略涉及：（1）缺點(diǎn)基因精確的原位修復(fù)，涉及對致病基因的突變堿基進(jìn)行糾正的基因矯正和用正?；蛲ㄟ^重組原位替代致病基因的基因置換。屬于精確修復(fù)，是最抱負(fù)的治療辦法。（2）基因增補(bǔ)：不刪除突變的致病基因，而在基因組中額外插入正?；?，在體內(nèi)體現(xiàn)出功效正常的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。（3）基因沉默或失活：對于某些由于某些基因過分體現(xiàn)引發(fā)的疾病，向患者體內(nèi)導(dǎo)入有克制基因體現(xiàn)作用的核酸，降解對應(yīng)的mRNA或克制其翻譯，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。基因治療的基本程序：（1）選擇治療基因：根據(jù)疾病的治病基因，選擇對應(yīng)的正?；蚧蛘咄ㄟ^改造的基因作為治療基因。（2）選擇基因載體：有病毒載體（臨床上慣用）和非病毒載體。（3）選擇靶細(xì)胞：普通是體細(xì)胞，慣用的如造血干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞。（4）將治療基因?qū)肴梭w，分：間接體內(nèi)療法，將靶細(xì)胞從體內(nèi)取出后進(jìn)行基因?qū)?，篩選出成功導(dǎo)入的細(xì)胞，繁殖擴(kuò)大后再輸回體內(nèi)，使治療基因在體內(nèi)體現(xiàn)；直接體內(nèi)療法，是將外源基因直接注入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入對應(yīng)細(xì)胞并體現(xiàn)。（5）治療基因體現(xiàn)的檢測：用PCR、RNA印跡、蛋白印跡及ELISA等辦法檢測導(dǎo)入的治療基因與否被正取體現(xiàn)。15.談?wù)勀銓虍惓：图膊“l(fā)生之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)。（一）人類全部疾病均為視為基因病。（1）影響疾病發(fā)生發(fā)展的基因分為致病基因和疾病易感基因，統(tǒng)稱為疾病有關(guān)基因。如果一種疾病的表型和一種基因型呈現(xiàn)直接對應(yīng)的因果關(guān)系，該基因就屬于致病基因，這類疾病重要是單基因病。復(fù)雜性疾病，如腫瘤、心血管疾病等，遺傳因素體現(xiàn)為2個(gè)以上基因甚至多個(gè)基因間的互相作用，單一