細(xì)胞工程學(xué)：第9章 植物離體受精

Chapter9細(xì)胞工程問(wèn)題：植物遠(yuǎn)緣雜交困難的原因之一是雜交不親和性，即種與種之間存在生殖隔離。分別如何克服？

◆克服受精前障礙的最有效方法：離體授精

◆克服受精后障礙：胚培養(yǎng)Copyright?2012Song,Allrightsreserved.第9章PlantIn

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(IVF)植物離體受精Chapter9細(xì)胞工程

理論意義：揭示植物受精生理生化機(jī)制和早期胚胎發(fā)育研究。§9-1植物離體受精1、植物離體受精概念：

指在體外無(wú)菌條件下培養(yǎng)未受精的子房、胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)進(jìn)入胚珠完成受精的技術(shù)。2、植物離體受精意義：PlantIn

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應(yīng)用意義①克服植物遠(yuǎn)緣雜交（雜種細(xì)胞培養(yǎng)困難）或自交不親和性（柱頭與花粉識(shí)別障礙），培育新品種；

體細(xì)胞雜交遠(yuǎn)緣植物間常發(fā)生：一方親本排除另一方染色體現(xiàn)象；雜種細(xì)胞不分裂、愈傷組織不分化；后代不穩(wěn)定等。②花粉管通道法轉(zhuǎn)基因植株培育。Chapter9細(xì)胞工程§9-2植物離體傳粉1、子房離體授粉

通過(guò)人工授粉方法，使花粉粒不經(jīng)柱頭和花柱直接進(jìn)入子房中的胚珠，完成受精作用，從而獲得遠(yuǎn)源雜種。方法:①直接引入法：在子房壁或頂端切個(gè)開(kāi)口，灌注以花粉懸浮液，完成授精過(guò)程。再離體培養(yǎng)。②注射法：在子房頂端和基部開(kāi)2個(gè)注射孔，用裝有花粉懸浮液的注射器從頂端注射，起到基部孔有流出；用凡士林封閉孔口，再離體培養(yǎng)。Copyright?2012Song,Allrightsreserved.Chapter9細(xì)胞工程離體胚珠人工授粉：取出帶胚座的胚珠直接在胚珠表面授予無(wú)菌花粉，再離體培養(yǎng)；將胚珠接種在撒落有花粉（可預(yù)培養(yǎng)）的培養(yǎng)基上完成授精。§9-2植物離體傳粉2、胚珠試管受精Copyright?2012Song,Allrightsreserved.Chapter9細(xì)胞工程§9-3植物體外受精體外受精必須先獲得有活力的精細(xì)胞和卵細(xì)胞:1、精細(xì)胞的獲得方法①研磨法：用研缽或玻璃勻槳器研磨破花粉細(xì)胞壁，釋放出精細(xì)胞。②滲透壓沖擊法：一步法：將花粉細(xì)胞置于低滲壓溶液中，細(xì)胞吸水脹破，釋放出精細(xì)胞。二步法：先將花粉細(xì)胞置于適宜濃度蔗糖溶液中水合適應(yīng)一段時(shí)間，再用水稀釋溶液成低滲液，使細(xì)胞脹破而釋放出精細(xì)胞。Copyright?2012Song,Allrightsreserved.Chapter9細(xì)胞工程§9-3植物體外受精③活體-離體法：精細(xì)胞的釋放：將人工授粉后形成的花粉管連同花柱切下，插入培養(yǎng)液中生長(zhǎng)直到精細(xì)胞出現(xiàn)，再切取基部用纖維素酶或果膠酶水解細(xì)胞壁，或采用低滲法釋放出精細(xì)胞。純化：用20-35目篩孔過(guò)濾除去雜質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)核細(xì)胞，再用密度梯度離心法分離出高純的精細(xì)胞。保存：精細(xì)胞保存在含有適當(dāng)濃度蔗糖、山梨醇糖等維持細(xì)胞滲透壓的培養(yǎng)基溶液中，并加入PDS/BSA/Ca2+等膜穩(wěn)定劑中，pH6-7。Copyright?2012Song,Allrightsreserved.Chapter9細(xì)胞工程§9-3植物體外受精2、卵細(xì)胞的分離方法（難度較大）①酶解法：用纖維素酶或果膠酶水解分離出胚囊，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，可離散出單個(gè)的卵細(xì)胞，再用吸管吸出，培養(yǎng)液中保存。②酶解-壓片法：

酶解胚珠后，再做裝片，擠壓出卵細(xì)胞。③酶解-解剖法：酶解胚珠后，在倒置顯微鏡下從胚珠解剖出卵細(xì)胞。Copyright?2012Song,Allrightsreserved.Chapter9細(xì)胞工程§9-3植物體外受精3、人工合子

采用人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法（PEG法、電融合法）促使精細(xì)胞與卵細(xì)胞融合，便形成人工合子，再經(jīng)胚胎發(fā)育成植株。

1991年，Klanz用電融合法首次在