2起食物中毒中副溶血性弧菌基因特征分析

2起食物中毒中副溶血性弧菌基因特征分析

嗜鹽細(xì)菌（vp）廣泛分布于生活在太平洋、魚類、其他礦產(chǎn)、食品和外部環(huán)境中。由于它喜歡鹽，它對(duì)溫度有很大的影響。副溶血性弧菌是導(dǎo)致人類急性胃腸炎的重要病原菌,尤其在沿海地帶,它是細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌。以往食物中毒檢測(cè)時(shí)存在著同1份病例或食品樣本中分離到的副溶血性弧菌往往有幾個(gè)血清型的狀況,但這些血清型之間是否存在遺傳相關(guān)性,是否屬于同一克隆組(clonecomplex),目前較少資料報(bào)道。1996年后O3:K6在全世界范圍內(nèi)流行,并出現(xiàn)了O4:K68、O1:K25、O1:KUT等脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)圖譜與O3:K6十分接近的菌株,形成了O3:K6克隆群,被稱為大流行株(pandemicstrain),與1996年以前的O3:K6菌株在toxRS基因上有7個(gè)堿基的不同,根據(jù)這一不同,GS-PCR方法被創(chuàng)建起來,用于區(qū)分新舊O3:K6克隆群。orf8可能編碼1種粘附蛋白,能增加副溶血性弧菌粘附于人類腸道細(xì)胞的能力或增加了其粘附于海生植物表面的能力,也是大流行株的判斷標(biāo)志之一。副溶血性弧菌臨床分離株多數(shù)可產(chǎn)生1種耐熱直接溶血素(TDH),可以裂解我妻氏血平板上的紅細(xì)胞,產(chǎn)生溶血環(huán),是目前所知的副溶血性弧菌主要的毒力因子,另外一種TDH相關(guān)溶血素TRH被認(rèn)為與脲酶的產(chǎn)生有關(guān),也被認(rèn)為是副溶血性弧菌的毒力因子之一。資料顯示,多數(shù)臨床分離株攜帶tdh基因,不攜帶trh基因。本文從血清學(xué)分型、毒力基因攜帶情況(tdh和trh基因)、大流行株判斷(GS-PCR和orf8基因陽性)、PFGE分型等多方面分析,對(duì)2起食物中毒中相同樣本不同血清型的副溶血性弧菌進(jìn)行基因特征分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1該菌株的來源1.1.3主要設(shè)備和分析軟件1.2方法1.2.1抗蟲菌的副溶血鑒定1.2.2中毒基因檢測(cè)1.2.3g-pcr和或f8基因檢測(cè)1.2.4PFGE2結(jié)果2.1生化鑒定結(jié)果第2起食物中毒共采集到12份樣本,經(jīng)過分離培養(yǎng),每份樣本挑取10個(gè)可疑菌落,共挑取120個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定,其中副溶血性弧菌80株,其中O3:K644株,O4:K8、O11:K36、O11:K19各10株,O1:K566株,非副溶血性弧菌40株,見表3。2.2遺傳因子和trh2.3基因或gs-pcr和f8的隨機(jī)性2.4pfga的結(jié)果2.4.1第一位中毒的pfga的結(jié)果2.4.2第二種是中毒的pfga的結(jié)果2.4.32.o3：k6中毒的pfga3水煮魚體內(nèi)各基因共感染試驗(yàn)本研究中同1份食品樣本最多分離到3種血清型的副溶血性弧菌,同1份肛拭中最多分離到2種血清型,說明副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,如果僅挑取1個(gè)可疑菌落容易造成漏檢。以第1起食物中毒為例,共有17個(gè)不同的血清型(不同樣本中血清型個(gè)數(shù)相加),如果每份標(biāo)本僅挑取1個(gè)可疑菌落,將分離到11個(gè)血清型,血清型漏檢率35.3%(6/17),以此類推,如果每份標(biāo)本分別挑取2、3、4、5個(gè)可疑菌落,將分離到11、13、14、16個(gè)血清型,血清型漏檢率分別為35.3%(6/17)、23.5%(4/17)、17.6%(3/17)、5.8%(1/17),只有每份標(biāo)本挑取12個(gè)可疑菌落,才能分離到目前已知的所有血清型,綜合成本-效益分析,本研究認(rèn)為每份樣本可以考慮挑取5個(gè)可疑菌落。本研究發(fā)現(xiàn),副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,那么,相同樣本中分離的不同血清副溶血性弧菌是否有遺傳關(guān)系,其遺傳特征是否一致?現(xiàn)對(duì)基因特征分析如下。第1起食物中毒中,3份肛拭子中(1-8,1-9,1-10)同時(shí)檢出O3:K6和O2:K28。結(jié)果顯示,O3:K6攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,GS-PCR和orf8基因陽性,屬大流行株,O2:K28不攜帶tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因陰性,不屬于大流行株。PFGE顯示O3:K6和O2:K28有7個(gè)以上條帶變化,根據(jù)Tenovar原則,O3:K6和O2:K28為遺傳不相關(guān)菌株。水煮魚(1-3)分離到3種血清型的副溶血性弧菌,O2:K28,O3:K25和O4:K12,它們不攜帶tdh和trh毒力基因,GS-PCR和orf8基因陰性,PFGE顯示,3種不同血清型的菌株有7個(gè)條帶以上的變化,為遺傳不相關(guān)菌株。第2起食物中毒中,餐盤涂抹樣(2-5)和肛拭子(2-6)都檢出O3:K6和O1:K56,O3:K6和O1:K56都攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,但O3:K6的GS-PCR和orf8基因陽性,屬大流行株,O1:K56的GS-PCR和orf8基因陰性,不屬于大流行株,PFGE顯示O3:K6和O1:K56有7個(gè)以上條帶變化,為遺傳不相關(guān)菌株。就本次研究顯示,來自相同樣本不同血清型的副溶血性弧菌屬于不同克隆,為遺傳不相關(guān)菌株。第1起食物中毒中,食品(1-1、1-2、1-3)和肛拭(1-8、1-9、1-10)中都分離到O2:K28,它們都不攜帶tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因陰性,且PFGE帶型基本一致,屬于高度相關(guān)菌株。結(jié)合流行病學(xué)資料,可以證明患者是食用了該食品受到感染。雖然O2:K28不攜帶tdh和trh毒力基因,但細(xì)菌的大量繁殖也會(huì)導(dǎo)致腹瀉等癥狀,或者O2:K28有尚未發(fā)現(xiàn)的致病因子。即使每份樣本挑取20個(gè)菌落,仍然不能找到病人肛拭中O3:K6的感染來源,說明單純靠多挑可疑菌落是不行的,或者感染來源并不限于這3種食品,還有其他感染來源未找到。另一原因可能是,非O3:K6菌株進(jìn)入人體后,發(fā)生了基因水平轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)變成O3:K6。Bhoopong等發(fā)現(xiàn)6株副溶血性弧菌分別在小鼠體內(nèi)傳代50次,其中有3株菌從O11:KUT轉(zhuǎn)變成O11:K15,但毒力不發(fā)生改變,而在體外傳代50次,血清型和毒力都不會(huì)發(fā)生改變,說明副溶血性弧菌在體內(nèi)復(fù)制過程中血清型的變異是可能發(fā)生的。第2起食物中毒中,從鹵雞蛋盤涂抹樣(2-5)中分離到了O3:K6和O1:K56,與病例分離的O3:K6和O1:K56各有1條帶的差異,屬高度相關(guān)菌株,推測(cè)是本次食物中毒的污染源。肛拭子(2-10)分離到O4:K8,攜帶tdh毒力基因,不屬于大流行株,推測(cè)屬于不同傳染源的感染。O11:K36攜帶tdh毒力基因,GS-PCR和orf8的結(jié)果顯示屬于大流行株,PFGE顯示,與O3:K6有5條帶的差異,為可能相關(guān)菌株。鹵雞蛋(2-1)中分離到的O11:K19,不攜帶tdh和trh基因,不屬于大流行株,PFGE帶型與O3:K6、O4:K8等也不一致,屬于不相關(guān)菌株,不能證明與本次食物中毒有關(guān)。綜上所述,前后2起食物中毒分離的O3:K6都是tdh陽性、trh陰性、GS-PCR和orf8陽性,PFGE帶型一致,屬于大流行株。沙門菌H9812,作為PFGE的分子量標(biāo)準(zhǔn),由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所惠贈(zèng)。1.1.2血清型菌株的篩選和pfge分析副溶血性弧菌瓊脂(上海市疾病預(yù)防控制中心),副溶血性弧菌診斷血清(日本生研株式會(huì)社),SeaKemGoldAgarose(美國CambrexBioScienceRockland),XbaI、NotI限制性內(nèi)切酶(大連寶生物公司),蛋白酶K(上海生工),一步法PCR試劑盒(上海生工)。VITEKDENSICHEK濁度儀(法國BioMérieux公司),恒溫水浴搖床(英國GRANT公司),脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(美國Bio-RadCHEFMapper),凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),BioNumerics圖像分析軟件(比利時(shí))。第1起食物中毒發(fā)生在2010年5月17日深圳市南山區(qū)某電子有限公司食堂,員工用餐后發(fā)生腹瀉、腹痛癥狀,感染人數(shù)有20人左右,采集到病人肛拭子9份,可疑食品3份,按照GB/T4789.7—2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)的要求,分別接種3%NaCl堿性胨水,37℃培養(yǎng)18h,劃線副溶血性弧菌瓊脂,37℃培養(yǎng)24h,每個(gè)平板上挑取20個(gè)可疑菌落,進(jìn)行鹽耐受試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定。第2起食物中毒發(fā)生在2010年7月1日深圳市南山區(qū)某配餐中心,客人用餐后發(fā)生腹瀉、腹痛癥狀,感染人數(shù)有10人左右,采集到病人肛拭子7份,可疑食品2份,涂抹樣3份,經(jīng)過上述相同的步驟,每個(gè)平板上挑取10個(gè)可疑菌落。參考文獻(xiàn)進(jìn)行。每份樣本挑選不同血清型的菌株各1株,水煮法提取DNA,采用多重PCR擴(kuò)增tdh和trh基因。引物見表1。參考文獻(xiàn)進(jìn)行。采用1.2.2中提取的DNA,進(jìn)行以下試驗(yàn)。GS-PCR在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行:5μLDNA,12.5μL2×PCR緩沖液,引物各0.25μL(10mmol/L),以及7μL滅菌蒸餾水。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性5min,96℃變性1min,45℃復(fù)性2min,72℃延伸3min,25個(gè)循環(huán),最后延伸72℃7min。引物見表1。參考文獻(xiàn)進(jìn)行。從2起食物中毒中挑取代表菌株,每份樣本的每種血清型至少1株,進(jìn)行PFGE。采用40U限制性內(nèi)切酶NotI于37℃酶切4h。H9812用XbaI50U37℃酶切2h作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳參數(shù):電壓6V/cm,電場(chǎng)夾角120°,起始轉(zhuǎn)換時(shí)間10s,終末轉(zhuǎn)換時(shí)間35s,電泳18h。用凝膠成像軟件Quantityone-4.4.0獲取圖像,BioNumerics4.0分析圖像,聚類分析采用非加權(quán)組平均法(unweightedpairgroupmethodwithaverages,UPGMA)方法和Dice系數(shù),按tolerance1.5%,optimization1.5%繪制聚類圖。第1起食物中毒共采集到12份樣本,經(jīng)過分離培養(yǎng),每份樣本挑取20個(gè)可疑菌落,共挑取240個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定,副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌分別為180和60株,其中O3:K6107株,O2:K2870株,O4:K34、O3:K25、O4:K12各1株,見表2。第1起食物中毒中,11份樣本中挑出17株菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè),分別是8株O3:K6、6株O2:K28、1株O4:K34、1株O3:K25、1株O4:K12,結(jié)果顯示,8株O3:K6攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,其他血清型tdh和trh基因都不攜帶,見圖1。第2起食物中毒中,8份樣本中挑出10株菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè),分別是5株O3:K6、2株O1:K56、1株O4:K8、1株O11:K36、1株O11:K19,結(jié)果顯示,除O11:K19不攜帶tdh和trh基因外,其他9株菌都攜帶tdh基因,不攜帶trh基因,見圖2。第1起食物中毒中,8株O3:K6GS-PCR和orf8基因陽性,其他血清型GS-PCR和orf8基因陰性(圖1)。第2起食物中毒中,5株O3:K6和1株O11:K36GS-PCR和orf8基因陽性,其他血清型GS-PCR和orf8基因陰性(圖2)。第1起食物中毒中,3份食品樣和3份肛拭子均分離到O2:K28,PFGE顯示,其中5株O2:K28的帶型一致,1株O2:K28(1-10-3)的帶型與其他5株不一致。8份肛拭子中都分離到O3:K6,PFGE帶型一致,O3:K6與O2:K28、O4:K12、O3:K25的帶型均不一致,見圖1。其中O4:K34由于復(fù)蘇時(shí)污染,未做PFGE。