加味桃核承氣湯及其拆方對糖尿病損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中pa和pai-1含量的影響

加味桃核承氣湯及其拆方對糖尿病損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中pa和pai-1含量的影響

以往的研究表明，加味桃核承氣湯對糖尿病及其心血管并發(fā)癥的預防和治療發(fā)揮了一定的作用。為了探討該處方對血管病變的影響，我們采用了血清藥理學和細胞培養(yǎng)方法。觀察了該處方及其合著者對人體肚臍靜脈內(nèi)皮細胞（huvec）——在高葡萄糖和高胰島素破壞環(huán)境下，組織類纖維溶酶原激活物（tpa）和plam-1（plam-1）的影響。結(jié)果如上所述。1材料和方法1.1材料分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)取自健康產(chǎn)婦順產(chǎn)新鮮臍帶,無菌取材,運輸液保存,冰袋冷藏取回實驗室立即進行分離,原代培養(yǎng)后傳2～3代用于實驗。1.2內(nèi)皮細胞生長添加物羅格列酮由葛蘭素史克(天津)有限公司生產(chǎn)(批號:04090081);細胞培養(yǎng)液:基礎(chǔ)培養(yǎng)液M199(LifeGIBCO,美國)加入2.0g/LNaHCO3、0.292g/LL-谷氨酰胺、3.0g/LHepes、10mL/L雙抗液(100倍);完全培養(yǎng)液[不含內(nèi)皮細胞生長添加物(ECGS)]:M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分數(shù)為20%胎牛血清(FCS);完全培養(yǎng)液(含ECGS):M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分數(shù)20%FCS+0.03g/LECGS;造模培養(yǎng)液:M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+體積分數(shù)20%FCS+0.03g/LECGS+20mmol/L葡萄糖+300mU/L胰島素;ECGS(LifeGIBCO,美國);膠原酶(LifeGIBCO,美國);tPA、PAI-1試劑盒(上海太陽生物技術(shù)公司)。1.3實驗動物中心采用清潔級SD雄性大鼠,體質(zhì)量180～220g,購買并飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心(合格證號:0004897)?；A(chǔ)鼠料總熱量6.94J/g(質(zhì)量分數(shù):蛋白質(zhì)23%、碳水化合物53%、脂肪5%)。1.4藥物處理及-不同濃度標準藥液加味桃核承氣湯(桃仁10g、大黃6g、桂枝6g、甘草3g、芒硝6g、黃芪30g、生地15g、麥冬12g、玄參12g)及其拆方稱量分組為加味方高、中、低劑量組,活血組(桃仁10g、桂枝6g、熟大黃6g),瀉熱通下組(大黃6g、甘草3g、芒硝6g),益氣養(yǎng)陰組(黃芪30g、生地15g、麥冬12g、玄參12g),原方組(桃仁10g、大黃6g、桂枝10g、甘草3g、芒硝6g)。將每組藥物(不含芒硝)用相當于藥材量5倍的自來水浸泡2h,武火煮沸后文火煎煮30min,過濾后收集煎液,加入芒硝,攪拌充分溶解。原渣再加水煎煮20min,過濾取煎液。兩液相混合,于水浴恒溫器上濃縮至5g/mL。1.5多次給藥和血樣采集大鼠灌胃藥物為加味桃核承氣湯及其拆方、羅格列酮(4mg);每日灌胃2次(早晚相隔12h),連續(xù)給藥3d。末次灌胃1h后采血(摘眼球法)。血樣靜置3h以上,待血塊收縮良好后,1500r/min離心15min;無菌吸取上層血清;滅活;加入硫酸汞、疊氮鈉,充分混勻;0.22μm微孔過濾器濾過除菌;分裝,-20℃保存。1.6理論等效劑量及實驗結(jié)果取經(jīng)純化及鑒定后的HUVEC分10組:正常組,模型組,羅格列酮(陽性對照)組,加味方高、中、低劑量組,活血組,瀉熱通下組,益氣養(yǎng)陰組,原方組。正常組和模型組均加入空白大鼠血清;加味方中劑量組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量由我們前期實驗成果決定,即大鼠理論等效劑量是人的單位體質(zhì)量劑量的5.75倍。因藥物血清的稀釋度為5,所以單位體質(zhì)量大鼠每次灌胃估計量為人的單位體質(zhì)量劑量的28.75倍。加味方高、低劑量組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量分別為前者的2倍和1/2倍;各配伍組所用藥物血清的供體大鼠灌胃量按加味方中等灌胃量計算而得。1.7細胞培養(yǎng)板密度選取長滿培養(yǎng)瓶底約80%的HUVEC進行傳代,細胞計數(shù),以1×104/孔用造模培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔體積200μL,共分9組,每組12孔(測tPA、PAI-1各6孔),另用普通培養(yǎng)液接種1組12孔(測tPA、PAI-1各6孔)正常培養(yǎng)細胞。置于體積分數(shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h,添加大鼠血清(空白血清或含藥血清),培養(yǎng)12h,取樣檢測。1.8-1噸/升采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法原理定量測定培養(yǎng)液中tPA、PAI-1水平。1.9統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行處理。數(shù)據(jù)方差齊者采用隨機方差分析;數(shù)據(jù)方差不齊者采用秩和檢驗。2羅格列酮對血清tpa、pai-1含量的影響表1結(jié)果顯示,模型組與正常組比較,tPA含量有降低的趨勢,但無顯著性差異(P>0.05);與模型組比較,活血組tPA含量增加(P<0.05),羅格列酮組亦可見這一改變(P<0.01)。模型組較正常組PAI-1含量顯著性升高(P<0.01);與模型組比較,加味方中、高劑量組,活血組,瀉熱通下組,原方組及羅格列酮組PAI-1含量均顯著性降低(P<0.01)。3對血管內(nèi)皮功能的影響血管內(nèi)血液流變學、血流動力學因素與血管內(nèi)皮正常功能密切相關(guān),而tPA和PAI-1對此起著重要作用。糖尿病(DM)并發(fā)血管病變的機制極為復雜,血管內(nèi)皮細胞功能的改變是其病理生理改變的重要環(huán)節(jié)。由血管內(nèi)皮細胞分泌的tPA和PAI-1共同調(diào)節(jié)纖溶酶的活性,DM患者tPA/PAI-1平衡失調(diào)提示血管內(nèi)皮功能受損,導致了DM血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,活血組、羅格列酮組可促進tPA含量增加,但模型組與正常組比較,tPA含量無顯著性差異,提示胰島素、葡萄糖可能不是通過tPA影響血管內(nèi)皮功能,具體機制有待于進一步研究證實。另一方面,模型組較正常組PAI-1含量顯著性升高;與模型組比較,加味方中、高劑量組,活血組,瀉熱通下組,原方組及羅格列酮組PAI-1含量均顯著性降低,而且加味方高劑量組、活血組、瀉熱通下組、