流式細(xì)胞儀在動(dòng)物性別控制中的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀在動(dòng)物性別控制中的應(yīng)用

性別控制（色情控制）技術(shù)是指通過(guò)手動(dòng)干預(yù)和操作，根據(jù)人類的設(shè)計(jì)和需要繁殖的性別后代的技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。在畜牧領(lǐng)域內(nèi),動(dòng)物性別控制技術(shù)可使乳用家畜多產(chǎn)雌性后代,肉用家畜多產(chǎn)雄性后代;在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi),這一技術(shù)可減少性連鎖遺傳病的發(fā)生概率。1第3種方法是測(cè)定精子的過(guò)程中出現(xiàn)的一些重要目前,主要采用3種方法控制哺乳動(dòng)物的性別:第1種方法是對(duì)受精后的胚胎進(jìn)行性別鑒定,然后移植所需性別的胚胎;第2種方法是通過(guò)控制受精環(huán)境的一些因素(如母畜生殖道的酸堿性、輸精時(shí)間等),從而達(dá)到抑制某種類型精子(X/Y精子)的活力;第3種方法是分別對(duì)攜帶有X染色體及Y染色體的精子進(jìn)行分離,然后再對(duì)分離后的精子進(jìn)行人工授精。雖然這3種方法在一定程度上都能達(dá)到控制后代性別比例的目的,但第1種方法從嚴(yán)格意義上講只能被稱為性別鑒定(sexidentification),并且這種方法會(huì)浪費(fèi)一半數(shù)量的胚胎,此外還需胚胎分割、胚胎移植等相關(guān)技術(shù)的配合,從而降低了這一技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。第2種方法在實(shí)際應(yīng)用中雖然操作簡(jiǎn)單,但由于受各種環(huán)境因素的影響使其難以得到精確控制,從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定;同時(shí)不同物種對(duì)同一處理方法會(huì)表現(xiàn)出一定的差異性。第3種方法具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛地應(yīng)用于哺乳動(dòng)物性別控制的研究中。目前,國(guó)內(nèi)外有多家公司可提供用于性別控制和已分離的X/Y精液。2流式細(xì)胞技術(shù)在研究X、Y精子分離的過(guò)程中,一些學(xué)者依據(jù)X精子與Y精子物理特性(體積、密度、電荷、運(yùn)動(dòng)性等)的不同,采用免疫學(xué)方法、密度梯度離心法、電泳法等方法進(jìn)行分離。由于這些方法控制性別的準(zhǔn)確性較低、重復(fù)性較差,目前已很少采用。1986年,Johnson等最早提出可根據(jù)X、Y精子DNA含量的不同采用流式細(xì)胞技術(shù)(flowcytometry)進(jìn)行X、Y精子的分離,并于1989年首次采用這一技術(shù)分離了兔的X、Y精子。此后,應(yīng)用這一技術(shù)相繼對(duì)豬、牛、綿羊、人等的精子進(jìn)行了分離。用流式細(xì)胞技術(shù)分離X、Y精子的原理在于:首先采用能和DNA定量結(jié)合的特異性熒光染料(如hoechst33342)對(duì)精子進(jìn)行活體染色;隨后將染色后的精子通過(guò)流式細(xì)胞儀,再由特異性熒光染料經(jīng)激光激發(fā)釋放出熒光;由于X精子DNA含量高于Y精子,從而使X精子產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)于Y精子,流式細(xì)胞儀可根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱分別使X精子、Y精子帶上正電荷或負(fù)電荷;當(dāng)攜帶正負(fù)電荷的X精子、Y精子通過(guò)高壓電場(chǎng)時(shí)就會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn),進(jìn)入不同的收集管,從而達(dá)到分離的目的。3不同授精方式、不同授精部位、受精率對(duì)受精率的影響目前,采用流式細(xì)胞技術(shù)分離X、Y精子的研究主要集中在兩個(gè)方面。首先,由于分離后的X、Y精子價(jià)格昂貴,人們?cè)噲D通過(guò)減少單次輸精量達(dá)到降低動(dòng)物繁殖成本的目的。因此,許多研究者用不同動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn),以確定在不影響受精率的情況下不同物種受精所需已分離的X/Y精子的最小數(shù)量,即所謂的“低劑量授精(lowdoseinsemination)”。其次,人們普遍認(rèn)為,分離后的X/Y精子受精率之所以低于未分離精子的受精率,可能是由于分離過(guò)程使精子受到損傷,從而影響分離后的精子活力。因而,研究者們?cè)噲D通過(guò)優(yōu)化分離過(guò)程達(dá)到減小精子損傷、增強(qiáng)已分離精子活力的目的。最新的研究表明,在“低劑量授精”的研究過(guò)程中,不同物種甚至同一物種的不同亞種正常受精所需已分離的X/Y精子數(shù)量不同。如綿羊15×106個(gè)已分離的X/Y精子與50×106個(gè)未分離的精子(商業(yè)劑量)受精率沒(méi)有差別。還有一項(xiàng)研究表明,更低數(shù)量(1×106)已分離的綿羊X/Y精子與商業(yè)劑量(50×106個(gè))未分離的綿羊精子在受精率上沒(méi)有差別。對(duì)于中國(guó)荷斯坦奶牛,2×106個(gè)已分離的X/Y精子的受精率低于15×106個(gè)未分離精子的受精率;而對(duì)于安格斯牛,2×106個(gè)已分離的X/Y精子與20×106個(gè)未分離的精子在受精率上沒(méi)有差別。在進(jìn)行“低劑量授精”時(shí),還應(yīng)考慮不同的授精方式、授精部位對(duì)受精率及產(chǎn)仔率的影響。目前,“低劑量授精”方式主要有3種:即通過(guò)外科手術(shù)將精子注入子宮角、常規(guī)人工授精將精子注入子宮體、體視授精(hysteroscopicinsemination)將精子注入宮管結(jié)合部。當(dāng)單次授精的精子數(shù)量足夠多時(shí),不同授精方式對(duì)受精率影響不大;而當(dāng)單次授精的精子數(shù)量較少時(shí),不同的授精方式對(duì)受精率的影響很大。MorrisLH等用馬的冷凍、解凍后的低劑量精子觀察不同授精方式(常規(guī)人工授精及體視授精)對(duì)受精率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)精子數(shù)量為14×106個(gè)時(shí),不同授精方式對(duì)受精率沒(méi)有影響,受精率分別為67%及64%,差異不顯著;而當(dāng)精子數(shù)量為3×106個(gè)時(shí),常規(guī)人工授精方法的受精率明顯低于體視授精方法,受精率分別為15%及47%,差異顯著。母畜的生殖年齡對(duì)低劑量精子的受精率也有影響。DeJarnette等用低劑量已分離的牛X精子進(jìn)行人工授精,研究青年母牛及經(jīng)產(chǎn)母牛妊娠率的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)于青年母牛,5×106個(gè)精子的妊娠率明顯高于2.1×106個(gè)精子的妊娠率,妊娠率分別為59.5%及46.4%,差異顯著;對(duì)于經(jīng)產(chǎn)母牛,兩種劑量的精子對(duì)妊娠率沒(méi)有影響,妊娠率分別為52.5%及46.7%,差異不顯著;同時(shí)不同種公牛來(lái)源的精子也表現(xiàn)出一定的差異。母畜的不同發(fā)情方式(自然發(fā)情及激素誘導(dǎo)發(fā)情)對(duì)低劑量精子的受精率也有影響。VazquezJM等分別使用70×106個(gè)及140×106個(gè)流式細(xì)胞儀分離的豬精子對(duì)自然發(fā)情及激素誘導(dǎo)發(fā)情的豬進(jìn)行人工授精。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同發(fā)情方式對(duì)豬的產(chǎn)仔率影響很大,自然發(fā)情及激素誘導(dǎo)發(fā)情的產(chǎn)仔率分別為25.0%、39.1%,32.0%、46.6%。在進(jìn)行“低劑量授精”研究的同時(shí),許多學(xué)者試圖通過(guò)優(yōu)化X、Y精子的分離過(guò)程從而達(dá)到減小分離過(guò)程中精子的損傷、提高分離后精子活力的目的。在采用流式細(xì)胞儀分離精子之前,首先要對(duì)精子進(jìn)行高度稀釋(8×105個(gè)/mL),高度稀釋勢(shì)必會(huì)對(duì)分離過(guò)程中的精子造成損傷,從而影響分離后精子的活力及受精能力。因此,許多學(xué)者試圖通過(guò)在稀釋液及冷凍保存液中添加一些保護(hù)性物質(zhì)(20%的蛋黃、一些抗氧化劑、精子膜蛋白異二聚體),從而減小在分離及冷凍過(guò)程中對(duì)精子的損傷。此外,在流式細(xì)胞儀分離精子的過(guò)程中,不同大小的分離壓也會(huì)影響分離后精子的活力。SuhTK等研究了高速流式細(xì)胞儀的分離壓對(duì)分離后牛及馬精子活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)分離壓分別為30psi(pounds/squareinch)及50psi時(shí),分離后的牛冷凍精子在解凍30min后的活力分別為48.0%及40.5%,解凍2h后的活力分別為40.2%及30.0%,差異顯著;當(dāng)采用30,40,50psi3種大小不同的分離壓分離馬的精子時(shí),精子的活力分別為40.6%、34.5%、30.1%,差異顯著。這一結(jié)果提示,在采用流式細(xì)胞儀分離精子的過(guò)程中,在不影響分離速度的情況下,要盡量采用較低的分離壓以減少高分離壓對(duì)精子造成的損傷。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離精子,其濃度非常低,因而在裝管冷凍或輸精前要采用離心的方式進(jìn)行濃縮。早期的研究表明,離心可增加精液內(nèi)反應(yīng)性氧的種類,反應(yīng)性氧對(duì)精子膜具有一定的損傷作用,并最終導(dǎo)致精子活力及受精能力下降;最新的研究表明,對(duì)分離后的精子采用自然沉淀法進(jìn)行濃縮可避免上述不利因素的影響。GarciaEM等將用流式細(xì)胞儀分離的豬精子分別收集