人脂肪間充質干細胞致瘤性實驗研究

人脂肪間充質干細胞致瘤性實驗研究

脂肪間充質干細胞是從脂肪組織中分離出來的具有干燥特征的細胞。由于它不僅具有很強的外展性和多向分析性能力，而且來源充分，易于分離和培育。它很快成為繼骨髓間充質干細胞之后的研究熱點。不論在組織工程還是基因治療方面都具有廣闊的應用前景。本文旨在通過體內和體外實驗研究人脂肪間充質干細胞是否具有致瘤性,以確保其臨床使用的安全性。1材料和方法1.1實驗材料1.2動物分組、藥物培養(yǎng)基和檢測1.2.1裸鼠體內致瘤性實驗動物按照體質量隨機分為空白對照組、陽性對照組和脂肪間充質干細胞組,每組雌雄各16只。脂肪間充質干細胞組每只注射1×107個hMSC-AT,陽性對照組每只注射2×106個Hela細胞,空白對照組注射同批次生理鹽水,3組均為每只0.2mL,于動物右前肢肋部皮下注射。分別于注射后3d、1個月、3個月、6個月頸椎脫臼處死動物后,對注射部位進行大體解剖觀察和病理組織學檢查,觀察腫瘤形成情況,每次雌雄各解剖4只動物。1.2.2軟瓊脂克隆形成實驗在6孔細胞培養(yǎng)板制備0.5%底層瓊脂,室溫凝固后,置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谑褂们?將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中平衡。取對數(shù)生長期細胞制備成單細胞懸液,按不同密度配成0.35%上層瓊脂。脂肪間充質干細胞終濃度分別為15000、7500、3000、1500、750、150個/孔。同時設立陽性對照孔(Hela細胞,5000個/孔)和空白對照孔。待培養(yǎng)基在室溫凝固后,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d。培養(yǎng)結束后,每孔中加入0.5mL0.2%結晶紫,染色至少1h后,顯微鏡下觀察,計數(shù)大于10個細胞的集落數(shù),并計算細胞集落克隆率,細胞集落克隆率=(平均細胞集落數(shù)/每孔中加入的細胞數(shù))×100%。2結果2.1裸鼠體內腫瘤實驗2.1.1動物注射部位病理組織學檢查空白對照組注射后各時間點注射部位未見任何異常。陽性對照組注射后3d,部分動物注射部位有小結節(jié)生長;注射后1個月,陽性對照組動物注射部位均有大小不一的瘤體生長;注射后3個月和6個月時部分瘤體已經潰爛。脂肪間充質干細胞組注射后3d,有部分動物注射部位有小結節(jié)生長,此后結節(jié)逐漸消失,至注射后6個月,該組動物注射部位均未見有瘤體生長,見圖1。2.1.2病理組織學檢查空白對照組注射后3d~6個月,注射部位病理組織學檢查均未見異常。陽性對照組在注射后3d,皮下組織或真皮內可見病灶結節(jié),灶內細胞分裂象多見;注射后1個月,灶內細胞巢狀排列,細胞分裂象多見;注射后3個月,灶內細胞巢狀和(或)腺樣排列,細胞分裂象多見;注射后6個月,灶內大部分細胞變性、壞死、鈣化,殘存的巢狀排列的細胞可見細胞分裂象。脂肪間充質干細胞組在注射后3d,真皮和(或)皮下組織內可見疏松排列的梭形細胞團;注射后1~6個月,注射部位病理組織學檢查未見異常,見圖2。2.2實驗2.2.1肉眼和顯微鏡觀察的結果陽性對照組在培養(yǎng)至17d時,肉眼及鏡下均可見有明顯的集落形成;而脂肪間充質干細胞組及空白對照組至培養(yǎng)結束均未見有集落形成。2.2.2腫瘤檢測結果培養(yǎng)21d后,陽性對照組的克隆形成率為2.7%,空白對照組和脂肪間充質干細胞組中均未見有集落形成。3脂肪間充質干細胞的致瘤性脂肪間充質干細胞不僅來源豐富、取材方便,而且同骨髓間充質干細胞有著相似的生物學特性,可作為組織工程的種子細胞來源,具有廣闊的基礎研究及臨床應用前景,為今后的細胞治療、基因治療提供新視野。但有越來越多的研究表明,間充質干細胞與腫瘤的形成與發(fā)展密切相關,這使得間充質干細胞在臨床應用中的安全性仍有待進一步研究證實。目前對于骨髓間充質干細胞的研究表明,長時間體外培養(yǎng),間充質干細胞能發(fā)生惡性轉化。Yamaoka等從24名志愿者的骨髓中分離提取間充質干細胞,并加入成纖維細胞生長因子2,培養(yǎng)出永生化的細胞系,移植入裸鼠體內后可以形成腫瘤,組織學檢查發(fā)現(xiàn)其中包含不同分化的脂肪和軟骨細胞。但Ra等在BALB/c裸鼠皮下注射傳代3代的脂肪間充質干細胞,劑量為2.0×108個細胞/kg,觀察26周后,未發(fā)現(xiàn)有致瘤性。本研究結果表明,在BALB/c裸鼠皮下接種人脂肪間充質干細胞后,前3d,部分動物在注射部位可以觀察到由細胞團塊形成的小結節(jié),隨后即被吸收,觀察到6個月時,未見其有致瘤性,與Ra等研究的結果一致。表明脂肪間充質干細胞是否具有致瘤性,可能跟其傳代次數(shù)有關。軟瓊脂細胞克隆形成實驗是一種旨在模擬活體內細胞外基質的半固體生長環(huán)境,進行體外檢測評估分析細胞純系化集落生長潛力的常用實驗方法。腫瘤細胞能無限增殖,表現(xiàn)出很強的克隆能力,而成熟分化的細胞則不能形成集落。本次實驗中,人脂肪間充質干細胞在軟瓊脂介質中無形成集落的能力,不具備致瘤性。綜上所述,人源脂肪間充質干細胞在短期傳代后不具備致瘤性,有一定的安全性。其長期傳代后是否具有致瘤性,還需進一步實驗來研究。人脂肪間充質干細胞(humanmesenchymaliposetissuehMSC-AT,)由山東省紅十字會介入醫(yī)院提供(第5代),批號:20090723P5、20101112P5;Hela細胞由山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院提供;SPF級BALB/c裸鼠96只,雌雄各半,體質量16~19g,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[生產許可證號:SCXK(軍)2007-004,合格證號:0054