睪丸消化細(xì)胞異位移植后移植物的免疫組化研究

睪丸消化細(xì)胞異位移植后移植物的免疫組化研究

睪丸形成和精子發(fā)生包括多細(xì)胞相互作用和許多信號分子的調(diào)節(jié)。異常的細(xì)胞或信號分子可能導(dǎo)致異常的睪丸發(fā)育和精神障礙。操作簡單、重復(fù)良好的實驗?zāi)Ｐ蜆O大地阻礙了人們對睪丸形成和精子發(fā)生的研究。近年來,人們發(fā)現(xiàn)新生鼠、豬、綿羊睪丸組織消化成單細(xì)胞移植后仍能重構(gòu)成有功能的睪丸組織,并且具有精子發(fā)生潛能。這一方法使研究者對移植物中不同細(xì)胞進(jìn)行分選和重新組合,從而進(jìn)一步研究各細(xì)胞的功能及其之間相互作用成為可能,并且為睪丸組織工程研究提供了實驗依據(jù),但相關(guān)研究尚不充分,且對于睪丸重構(gòu)的各個細(xì)胞組分和機(jī)制尚無深入報道。本研究采用新生ICR小鼠睪丸消化細(xì)胞異位移植重構(gòu)生精小管,為研究睪丸發(fā)育及精子發(fā)生提供技術(shù)模型,并為進(jìn)一步研究睪丸不同細(xì)胞之間的相互作用及組織工程重建睪丸組織打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1各類抗的藥理性質(zhì)出生1～2d的SPF級雄性ICR小鼠和6周齡雄性BALB/c-nu/nu無胸腺裸鼠購于上海斯萊克。胰酶購于美國GIBCO公司,Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNase均購于美國Sigma公司,Matrigel基質(zhì)膠(MGM)購于美國BD公司,Mvh單克隆抗體(以下簡稱單抗)、Gata4單抗、P450Scc單抗分別購于英國Abcam公司、美國SantaCruz公司、美國Millipore公司。TCSSP5共聚焦熒光顯微鏡、體式顯微鏡、光學(xué)顯微鏡為德國萊卡公司產(chǎn)品。1.2動物飼養(yǎng)及手術(shù)處理新生1～2d的雄性ICR小鼠直接用于睪丸消化細(xì)胞的制備。SPF級6周齡雄性BALB/c-nu/nu無胸腺裸鼠20只,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)Bio-X生命科學(xué)研究中心動物房,保持20～22℃恒溫,12h光照和黑夜循環(huán),高溫滅菌水和輻照滅菌飼料喂養(yǎng),食物和水均為隨意攝取,每籠5只。每只裸鼠睪丸細(xì)胞移植術(shù)完成同時行手術(shù)去勢。手術(shù)完成后置于上述條件下繼續(xù)飼養(yǎng),密切觀察切口生長和愈合情況,觀察裸鼠食欲、行為、狀態(tài)等,注意移植物的生長情況。1.3dmem的消化將新生1～2d雄性ICR小鼠處死后75%酒精浸泡5min,0.01mol/LPBS沖洗2次,無菌條件下取出小鼠睪丸,去除附睪及睪丸周圍的脂肪組織等;將睪丸組織放入1.5mlEppendorp管中,用眼科剪將其剪成糊狀,加入10倍體積含Ⅱ型膠原酶(2mg/ml)和DNase(10μg/ml)的DMEM,置于37℃搖床100r/min震蕩消化20min;將上述液體1000r/min離心5min后去除上清,加入10倍體積含Ⅱ型膠原酶(2mg/ml)、透明質(zhì)酸酶(2mg/ml)和DNAse(10μg/ml)的0.05%的胰酶,置于37℃搖床150r/min震蕩消化20～30min,加入FBS終止消化;1000r/min離心5min,吸去上清,DMEM液洗2次,離心,DMEM液重懸細(xì)胞并計數(shù),使細(xì)胞濃度約為40～120×106/ml;將上述細(xì)胞懸液與等體積MGM混合配成終細(xì)胞濃度為20～60×106/ml濃度的細(xì)胞懸液備用。1.4細(xì)胞懸液的移植取6周齡雄性BALB/c-nu/nu裸鼠用阿氟酊腹腔麻醉,75%酒精消毒,將細(xì)胞懸液用26G套管針移植于裸鼠背部皮下,每側(cè)6個點,每個點0.05ml,移植完成后即對裸鼠行手術(shù)去勢。1.5組織染色及免疫熒光分別于移植術(shù)后第4、6、8、10周取5只裸鼠,將其麻醉后脫頸致死,剪開背部皮膚,手術(shù)取下移植物,快速測量移植物的最大和最小直徑,然后將移植物標(biāo)本置于Bouins液和4%多聚甲醛中備石蠟切片HE染色和冰凍切片免疫熒光染色。將Bouins液中的標(biāo)本4℃固定過夜,流水沖洗6h,常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色后封片,觀察組織生精小管重構(gòu)情況及精子發(fā)生。將4%多聚甲醛中的標(biāo)本4℃固定過夜,蔗糖梯度脫水后OCT包埋,快速冰凍并切片,常規(guī)進(jìn)行封閉液封閉,分別與一抗Mvh、Gata4、P450Scc4℃孵育過夜,二抗孵育,DAPI染細(xì)胞核,封片劑封片,熒光共聚焦顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡觀察移植物中Mvh、Gata4和P450Scc的表達(dá)。1.6統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用SAS9.13軟件對不同組別均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1移植物表面形態(tài)觀察20只受體鼠去勢及接受供體睪丸消化細(xì)胞移植后全部存活,生活狀態(tài)無明顯異常。受體鼠接受睪丸消化細(xì)胞移植后可見明顯突起的包塊,約于2d后包塊消失。移植后4周,部分受體鼠背部又重新可見明顯隆起的包塊,包塊大小隨時間延長逐漸增大。分別于移植后第4、6、8周取移植物觀察,可見移植物為球形或扁平組織;各移植物表面均有纖維組織膜包裹;可見血管生成并深入移植物內(nèi)部生長,血運豐富。移植物直徑由第4周的(3.91±0.71)mm增加到第10周的(6.69±0.50)mm(表1,圖1)。2.2生精小管結(jié)構(gòu)的發(fā)育對移植物進(jìn)行石蠟切片HE染色發(fā)現(xiàn),睪丸消化細(xì)胞移植后4周后能夠重構(gòu)成生精小管樣結(jié)構(gòu),管腔內(nèi)可見支持細(xì)胞和生精細(xì)胞。但組織中管腔大小不一,有不規(guī)則管腔,組織間質(zhì)較多。隨著移植物繼續(xù)生長,生精小管結(jié)構(gòu)大量出現(xiàn),管腔增大。移植后6周生精小管內(nèi)可見精原細(xì)胞和各級生精細(xì)胞由基底膜至管腔有序排列。移植后8周,部分生精小管管腔內(nèi)可見由精原干細(xì)胞發(fā)育至精子細(xì)胞的各級生殖細(xì)胞,未見明顯精子產(chǎn)生。移植10周末生精小管管徑明顯增大,管壁變薄,細(xì)胞層數(shù)減少,可見生精小管細(xì)胞脫落(圖2)。2.3物mvh表達(dá)對8周移植物進(jìn)行免疫組化觀察,可見生精小管內(nèi)細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)志物Mvh,并顯示生殖細(xì)胞由基底膜至管腔分層排列(圖3);小管內(nèi)也可見支持細(xì)胞標(biāo)志物Gata4的陽性表達(dá),但表達(dá)較少(圖4);同時移植物間質(zhì)內(nèi)可見大量細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物P450Scc(圖5)。3血供的移植及生精材料的選擇男性不育已成為困擾人類健康的重大問題,睪丸形成和精子發(fā)生的研究對男性不育的診斷和治療具有極其重要的意義。睪丸形成和精子的發(fā)生是一個高度復(fù)雜的細(xì)胞增殖和分化過程,不僅涉及睪丸中生精細(xì)胞與體細(xì)胞之間的相互作用,還有眾多的基因和激素參與協(xié)同調(diào)控。由于在體外很難模擬體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控過程,而在體內(nèi)也缺少合適的研究模型,這阻礙了睪丸形成和精子發(fā)生研究的進(jìn)展。生精小管注射的方法使我們對精子發(fā)生研究有了很大的突破,但這僅限于種屬關(guān)系較近的動物,并且也未提供有效的研究睪丸形成的方法。本研究證實新生小鼠睪丸消化細(xì)胞裸鼠皮下移植后不僅可以形成睪丸樣的組織,并且可啟動正常睪丸的發(fā)生發(fā)育過程,可以為未成熟生殖細(xì)胞的發(fā)育提供適宜的微環(huán)境。已有研究表明未成熟哺乳動物的睪丸組織塊移植入裸鼠背部皮下后可以繼續(xù)發(fā)育為成熟睪丸并可有完整精子發(fā)生,國外也有采用新生動物睪丸單細(xì)胞皮下移植的方法重建睪丸組織的研究,但相關(guān)研究尚不充分,且對于睪丸重構(gòu)的各個細(xì)胞組分和機(jī)制尚無深入報道。本研究首先將新生小鼠的睪丸經(jīng)過兩步酶法消化得到單細(xì)胞懸液,然后將其移植入裸鼠背部皮下,結(jié)果表明移植后分散的細(xì)胞又重新遷移、定植和生長,重構(gòu)成為與正常小鼠睪丸類似的結(jié)構(gòu)。睪丸維持精子發(fā)生需要較高濃度的睪酮,但在睪丸形成初期需要低睪酮環(huán)境,所以研究中一般采用去勢雄性動物作為受體。并且去勢動物體內(nèi)下丘腦-垂體-性腺軸負(fù)反饋通路被破壞,血清中卵泡刺激素和黃體生成素水平增加,可以刺激移植細(xì)胞增殖,并且可以促進(jìn)移植細(xì)胞與下丘腦和垂體建立負(fù)反饋通路。因此,實驗中將新生小鼠睪丸消化得到的生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等混合后移植入裸鼠體內(nèi),細(xì)胞能夠繼續(xù)增殖遷移,形成睪丸組織并能維持精子發(fā)生。移植物能否存活很大程度上取決于血供,本實驗選取裸鼠背部皮下作為移植部位,該處組織疏松,血運豐富,移植后容易建立有效血供,有足夠的生長空間。移植8周后本實驗中63.33%的移植物存活。但同時,由于該處組織較為松弛,移植后的細(xì)胞也較容易流失,這是部分移植物重構(gòu)失敗的一個重要原因。選取其他血供豐富而組織較緊密的部位移植,或者選用具有更優(yōu)粘附能力和機(jī)械性能的支架材料有可能很好地解決這一問題。對移植物取材進(jìn)行HE染色和免疫組化分析,可見與正常小鼠相似的睪丸發(fā)育,但生精小管形狀不規(guī)則,并且雖然形成了很多管腔結(jié)構(gòu),但并不是每個管腔里都有支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞,生精細(xì)胞排列層次及數(shù)量較少,重構(gòu)的生精小管中未發(fā)現(xiàn)明顯的精子。同時,間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也較少,但間質(zhì)部分所占比例較大,其中含有炎癥反應(yīng)細(xì)胞及纖維細(xì)胞。重構(gòu)睪丸組織中細(xì)胞數(shù)量較少,這可能是由于睪丸細(xì)胞,尤其是生殖細(xì)胞的存活條件要求較高,并且移植后的炎癥反應(yīng)也影響了細(xì)胞增殖。睪丸內(nèi)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了精子發(fā)生的微環(huán)境,這對睪丸發(fā)育及生殖細(xì)胞增殖分化起著非常重要的作用,多種生精功能障礙與支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能改變有很大的關(guān)系。重構(gòu)睪丸組織中缺少足夠的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞,并且受體鼠體內(nèi)激素水平可能與正常小鼠存在差別,無法提供維持完整精子發(fā)生的微環(huán)境,這可能是未見明顯成熟精子的重要原因,因此,在移植前對睪丸細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)或者補(bǔ)充外源性激素水平有可能解決這一問題。睪丸消化細(xì)胞異位移植重構(gòu)睪丸對研究睪丸的形成及精子發(fā)生、保存男性生殖能力、研究藥物對男性生殖系統(tǒng)的生殖毒性等都有極為重要的意義。首先,睪丸消化細(xì)胞異位移植重構(gòu)睪丸可以用來研究支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及肌樣細(xì)胞如何重構(gòu)成生精小管及其在這一過程中的相互作用,還可以用來研究如何利用體外培養(yǎng)的方法產(chǎn)生精子,從而研究男性不育的發(fā)病機(jī)制并尋求不育癥的治療方法。其次,對于兒童時期有可能因腫瘤而造成生殖功能破壞的患者,可以及早保存其睪丸,待其治愈后并有生育需求時將細(xì)胞復(fù)蘇并分選出正常的有功能的睪丸細(xì)胞,采用睪丸消化細(xì)胞移植重構(gòu)的方法重建生精過程,結(jié)合輔助生殖技術(shù)使其獲得子代。再次,此種方法還可以研究藥物對人的生殖毒性,甚至可以進(jìn)一步研究藥物分別對支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及生精細(xì)胞的影響,從而了解其對精子發(fā)生的