多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建策略

多基因共表達(dá)載體的應(yīng)用表達(dá)異源多聚體蛋白的亞單位，如免疫球蛋白、細(xì)胞受體、白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)錄因子等同時(shí)表達(dá)針對同一靶細(xì)胞的幾種異源蛋白以取得聯(lián)合或協(xié)同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自殺基因等。策略一：多啟動(dòng)子表達(dá)載體原理：帶有各自獨(dú)立啟動(dòng)子的多個(gè)表達(dá)盒構(gòu)建于一個(gè)載體上，轉(zhuǎn)錄出多種不同的mRNA，并翻譯出不同的蛋白。優(yōu)點(diǎn)：簡便缺點(diǎn)：①內(nèi)部啟動(dòng)子占據(jù)載體上有限的克隆空間②啟動(dòng)子間相互干擾，造成不同基因的表達(dá)水平不一致策略二：剪切載體原理：利用一個(gè)啟動(dòng)子，在外源基因兩側(cè)提供剪切供體/受體位點(diǎn)，通過剪切初始轉(zhuǎn)錄本，形成不同的mRNA，分別表達(dá)兩個(gè)基因缺點(diǎn)：可變剪切機(jī)制未明，雙基因表達(dá)效率很不穩(wěn)定不同來源的IRES序列組成不同，長度各異，在不同細(xì)胞類型中的作用也各異來源于鬧心肌炎病毒EMCV的該序列又稱為不依賴帽的翻譯增強(qiáng)子，在大部分細(xì)胞中可直接招募核糖體起始其下游順反子的翻譯。但對其實(shí)密碼的位置要求嚴(yán)格，只有該序列中的第11個(gè)可作為起始密碼。來源于脊髓灰質(zhì)炎或口蹄疫病毒的IRES序列對其后的任一個(gè)符合KOZAK序列的AUG均可有效的起始翻譯，因而得到更為廣泛的應(yīng)用。IRES序列置于兩個(gè)順反子之間時(shí)，它與第一個(gè)順反子的終止密碼的最佳距離為80bp。少于40或多于300-400bp會(huì)大大的降低IRES序列的翻譯效率。策略五：基因之間以Furin的切割靶點(diǎn)序列連接原理：Furin是一種廣泛存在的胞內(nèi)蛋白酶，定位于高爾基復(fù)合體，在真核生物高度保守，可識(shí)別各種分泌型蛋白前體的精-X-精/賴-精氨酸共有序列并在此位點(diǎn)對其進(jìn)行切割。利用這一點(diǎn)，將編碼切割位點(diǎn)的連接子置于分泌蛋白或膜結(jié)合蛋白的cDNA序列間，轉(zhuǎn)錄時(shí)可以得到一條單順反子，翻譯成嵌合的融合蛋白，在加工過程中Furin切割成各個(gè)分離的蛋白產(chǎn)物，進(jìn)而進(jìn)行分泌性表達(dá)。特點(diǎn)：可以多基因表達(dá)。表達(dá)蛋白的摩爾比由載體上的編碼序列數(shù)決定細(xì)胞選擇性：COS細(xì)胞中Furin含量少，融合基因的各蛋白表達(dá)量低;CHO細(xì)胞中，精-X-賴-精介導(dǎo)的切割效率為50%，而精-X-精-精只有30%。策略六：基因之間以2A序列連接原理：2A是一種具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的長度、作用位點(diǎn)各不相同。在口蹄疫病毒中的2A序列有長短兩種類型，長型有201bp，編碼39個(gè)氨基酸，短型有96bp，編碼17個(gè)氨基酸。兩者作用相似，均可獨(dú)立的用于構(gòu)建多基因載體。將兩基因分別克隆到2A序列的兩側(cè)，去除上游基因的終止密碼形成單一的開放閱讀框，翻譯出的多聚蛋白可在編碼2A區(qū)域的C末端被切割為兩個(gè)蛋白，上游蛋白融合了2A的C端多肽，并釋放出完整的下游蛋白。2A與Furin的不同之處：①2A的切割位點(diǎn)在自身C端最末位的兩個(gè)氨基酸之間（甘-脯）②切割作用伴隨翻譯過程完成③切割活性高達(dá)85%-99%但是具體的切割機(jī)制不明可用于與IRES序列一