利用反相色譜法檢測乳腺癌細胞中基因組dna甲基化水平

利用反相色譜法檢測乳腺癌細胞中基因組dna甲基化水平

廣泛的甲基甲基化在植物和動物體內被用作不同生理條件下的形態(tài)特征。常用的分析方法主要是配有紫外檢測的高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE),HPLC結合電噴霧質譜(ESI-MS)聯用技術也越來越常用,目前反相高效液相色譜技術被公認為檢測核苷酸、堿基的理想方法。近年來的研究表明,DNA的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,因此甲基化的程度與狀態(tài)為臨床腫瘤等疾病的診療提供了可信的科學數據。本研究利用反相高效液相色譜法對乳腺癌細胞MCF7基因組DNA的甲基化水平進行檢測,建立研究DNA甲基化的色譜技術平臺,為進一步的研究奠定實驗基礎。1材料和方法1.1測器、溶劑過濾系統(tǒng)、標準品戴安公司Ultimate3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司,包括WPS-3000自動進樣閥、VWD-3400RS可調波長紫外檢測器、FLM-3100柱溫箱、DGP-3600M壓力泵),溶劑過濾系統(tǒng)(美國Millipore公司)、安瓿瓶(美國Agilent公司)。堿基標準品(購自美國Sigma公司):脫氧胞嘧啶(dC)和甲基化脫氧胞嘧啶(5mdC);甲醇為色譜純(德國Merck公司);實驗用水為Milli-Q超純水;醋酸銨、核酸酶P1、DNA酶Ⅰ、RNA酶A購自美國Sigma公司;堿性磷酸酶購自美國NEB公司。1.2方法1.2.1rna酶a去除rna的酶a體外培養(yǎng)乳腺癌MCF7細胞的DNA采用QIAampDNABloodMiniKit提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取后,用終濃度為10μg/ml的RNA酶A去除含有的RNA;DNA水解過程參照已有文獻的方法:10μgDNA溶于10μTris-Cl(25mmol/L,pH8.0),10U的DNA酶Ⅰ在37℃處理1h,再100℃變性3min,迅速于冰上冷卻10min,加入1μl核酸酶P1后放入37℃水浴中16h,然后加入堿性磷酸酶1.5U處理2h,于-20℃保存。1.2.3質量濃度配比根據人類基因組DNA甲基化水平約為5%,因此將購買的標準品5mdC和dC按照質量濃度比1∶20配制。其中5mdC質量濃度系列為:1、2、4、8ng/μl,dC質量濃度系列為:20、40、80、160ng/μl。利用優(yōu)化的實驗條件,進樣量為0.2μl。1.3dna甲基化水平數據處理軟件為ChromeleonVersion6.80(美國Dionex公司);采用外標法定量,以W(5mdC)/[W(dC)+W(5mdC)]100%(單位為ng/ngDNA)的方式來表征DNA甲基化水平。根據標準品的標準曲線計算出樣品中dC和5mdC各自的含量,然后通過公式:(5mdC)%=W(5mdC)/[W(dC)+W(5mdC)]100%,得出MCF7細胞系DNA甲基化水平。2結果2.1色譜條件優(yōu)化實驗用的兩個C18反相柱分別是戴安公司的Nano和Micro柱,即柱子的直徑為75μm和1.0mm,已經測試合格,并具有較佳的柱效。對于流動相的選擇,本研究用醋酸銨-甲醇、酸化甲醇-甲酸、醋酸銨-乙腈溶液等多種流動相進行試驗,結果表明以醋酸銨-甲醇溶液得到的分離效果最好。將已稀釋成不同濃度的標準品dC和5mdC為樣品進行分離條件的優(yōu)化,當線性梯度洗脫條件為:0~20min,0~30%甲醇,7.5%醋酸銨時,dC與5mdC可以達到完全分離(圖1)?？梢钥闯?采用MicroLC體系的分離圖,峰寬較窄,分辨率較高,分離效果明顯優(yōu)于NanoLC體系,故以后實驗采用MicroLC體系。2.2微膠囊的制備將5mdC和dC的母液按1∶20的質量比混合,再逐級稀釋至濃度分別為1、2、4、8ng/μl和20、40、80、160ng/μl。實驗采用MicroLC體系,使用的定量方法為外標法。將各稀釋液分別進樣0.2μl進行檢測,以濃度為橫坐標,積分面積為縱坐標繪制標準曲線(圖2),相關系數r分別為99.82%和99.89%。2.3確性和重復性研究實驗采用人乳腺癌細胞MCF7基因組DNA水解產物作為質量控制樣品,對本方法的準確性和重復性進行了研究。取平行樣品在同一天內不同時間以及同一樣品在不同天數進行重復測試,結果表明5mdC和dC測定值平行樣相對標準偏差、樣品的日內偏差和日間偏差(RSD)范圍在2%~5%(表1),表明本方法具有良好的重復性。2.4保留時間的確定利用上述分析方法對人乳腺癌MCF7細胞內基因組DNA甲基化水平進行檢測,將標準品與樣品MCF7的水解產物進行比對,發(fā)現標準品的兩個峰圖即dC與5mdC與樣品中的兩個峰匹配完好,可得到各自的保留時間:dC為5.747min,5mdC為7.753min(圖3);同時,將該結果圖整理得到表2。最后,根據標準品的標準曲線計算得出樣品中的dC和5mdC的含量,進而得出MCF7細胞系DNA甲基化水平為19.3%。3dna甲基化檢測近幾年,表觀遺傳學改變的研究取得了長足進展,成為腫瘤臨床基礎研究的一個熱點領域。表觀遺傳學是研究非DNA序列變化引起的基因表達的改變,是研究表達在時間和空間上的調控問題,其中最主要的研究內容就是DNA甲基化。DNA甲基化修飾是指在DNA甲基轉移酶作用下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上,癌基因多為不充分甲基化,導致表達異常;抑癌基因多為過度甲基化,導致表達不足[8~10]。對腫瘤DNA甲基化的研究,應根據目的選擇合適的方法,明確是研究整體水平的甲基化還是研究特定位點的甲基化。對DNA中CpG島的甲基化分析涉及多種分子生物學方法,如甲基化敏感的限制性內切酶方法、NaHSO3法(包括BSP測序法、甲基化特異性PCR、熒光定量法)、芯片技術等。對DNA整體甲基化水平的研究,主要靠的是高效液相色譜、質譜等精密儀器?？梢?研究基因組DNA甲基化的方法多種多樣,一方面說明甲基化研究難度大,另一方面也說明這些方法都存在著局限性。本次研究通過采用反相色譜技術對乳腺癌細胞MCF7中基因組DNA甲基化水平的檢測,成功將DNA水解產物進行分離、定量。通過研究發(fā)現,DNA水解產物對于C18反相柱為弱保留化合物,流動相選用甲醇-醋酸銨緩沖液較為合適;比較MicroLC和NanoLC的分離圖譜,雖然二者都足以達到分離效果,但前者可以得到較窄的峰寬圖,因此其分離效果要優(yōu)于NanoLC;對MCF7細胞系甲基化的總體水平定量檢測發(fā)現,反相HPLC可以得到較佳的分析重現性,樣品定量結果表明,MCF7基因組甲基化水平高于正常細胞,推測該細胞系中的部分抑癌基因甲基化程度過度異常,導致抑癌基因表達下降,使腫瘤發(fā)生。總之,建立基于高效液相色譜(HPLC)技術的DNA甲基化研究平臺,可以為今后進一步研究某種基因甲基化的特定位點奠定基礎,此外,深入研究DNA甲基化與基因表達的關系及作用機制為腫瘤的早期診斷與臨床治療提供了新的思路。1.2.2反相柱及色譜條件戴安Ultimate3000型HPLC系統(tǒng),色譜柱為戴安公司NanoLC(75μm×15cm,5μm粒徑)和MicroLC(1.0mm×15cm,5μm粒徑)的C18反相柱。流動相:A,去離子水;B,50mmol/L醋酸銨(pH5.0)