中藥單體組方梓葛凍干粉對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

中藥單體組方梓葛凍干粉對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

子葛冷凍粉末是實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自己創(chuàng)造的抗腦缺血兵中藥物的復(fù)方。它由“千金方”治療中風(fēng)著名方劑羌活湯的主要成分是子醇和葛根素。該處方和制備技術(shù)在獲得國(guó)家技術(shù)專(zhuān)利申請(qǐng)后得到了批準(zhǔn)。課題組既往研究表明,梓醇能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng),促進(jìn)腦缺血大鼠缺血周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)血管新生,同時(shí)改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,并能顯著改善局灶性永久性腦缺血大鼠神經(jīng)功能。葛根素具有神經(jīng)保護(hù)作用,減輕大鼠腦缺血再灌注損傷,改善神經(jīng)行為活動(dòng)。梓葛凍干粉具有抗大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞永久局灶性腦缺血的作用,可顯著減少腦梗死面積,改善模型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能。缺血性腦卒中是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,涉及到自由基損傷、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面。血管內(nèi)皮細(xì)胞是缺血/再灌注損傷中自由基和多種損傷性因子作用的重要靶點(diǎn),血管內(nèi)皮細(xì)胞受損活化是缺血/再灌注損傷病理演變過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。依據(jù)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞缺血/再灌注損傷過(guò)程中組織間液的變化(包括缺氧、乳酸堆積、酸中毒和糖耗竭等)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人體生理的相似性和可獲得性,本實(shí)驗(yàn)采用Krebs液制備人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型,模擬整體動(dòng)物的缺血/再灌注損傷過(guò)程,觀察梓葛凍干粉對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型損傷的保護(hù)作用,并初步探討其作用機(jī)制,為梓葛凍干粉治療腦缺血卒中提供主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料表面1.1-actin抗體梓葛凍干粉由西南大學(xué)中藥研究所提供,主要成分為梓醇和葛根素,批號(hào)為20100512;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;Hyclone血清購(gòu)自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司,批號(hào)NVM0347;Bcl-2,Bax,Caspase-3,GAPDH,β-actin抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑和PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;一氧化氮(NO)測(cè)試盒(批號(hào)20100902),丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20100728),超氧物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)20100728),乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號(hào)20100312),均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;胰蛋白酶,四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。尼莫地平購(gòu)自德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào)J20100002;其余試劑如二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸等均為進(jìn)口分裝或市售分析純。1.2紫外分光光度計(jì)CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NACPO6000);電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad);紫外分光光度計(jì)(日立高新U-3010);純水系統(tǒng)(Millipore);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf5417R);超低溫冰箱(Thermo);倒置顯微鏡(德國(guó)ZissIX71),酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTekElx800),缺氧裝置乃本實(shí)驗(yàn)室自制。2方法2.1格局生物—體外缺血再灌注模型的建立模型參考文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)常規(guī)培養(yǎng)48h后,棄掉培養(yǎng)基,用D-Hanks液沖洗2次,將所有孔換成無(wú)血清缺氧培養(yǎng)液(Krebs液),放入經(jīng)95%N2,5%CO2的混合氣飽和的密閉自制缺氧容器中,同時(shí)繼續(xù)通入95%N2,5%CO2的混合氣,37℃培養(yǎng)4h,然后取出培養(yǎng)板,將缺氧培養(yǎng)液換成復(fù)氧培養(yǎng)液后于37℃,5%CO2條件下復(fù)氧培養(yǎng)2h。2.2復(fù)氧時(shí)劑量的確定(1)正常對(duì)照組:細(xì)胞在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng);(2)缺氧/復(fù)氧模型組:細(xì)胞在給予上述缺氧處理4h后再于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2h;(3)尼莫地平組:在復(fù)氧時(shí)加入2.1mg·L-1的尼莫地平,其余過(guò)程同模型組;(4)梓葛凍干粉組:在復(fù)氧時(shí)分別加入49.0,24.5,12.5mg·L-1的梓葛凍干粉,其余過(guò)程同模型組。梓葛凍干粉和尼莫地平均以0.9%的生理鹽水溶解,分別按49.0,24.5,12.5,2.1mg·L-1加入培養(yǎng)基中。在復(fù)氧時(shí),各給藥1次。同時(shí)對(duì)照組和模型組給予相同體積的0.9%生理鹽水。每組均設(shè)復(fù)孔6個(gè)。2.3dmso檢測(cè)a采用MTT法。吸棄培養(yǎng)基,PBS洗3次,96孔板每孔加入5g·L-1的MTT溶液各15μL,于培養(yǎng)箱中37℃,5%CO2條件下孵育4h后,棄去MTT液,每孔加入100μL的DMSO,振蕩器輕輕混勻10min后,以酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)檢測(cè)A。2.4mda,no含量和sod活性檢測(cè)復(fù)氧2h后,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次。加入300μL細(xì)胞裂解液于冰上裂解30min后,高速冷凍離心機(jī)離心10min,取100μL細(xì)胞上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用硫代巴比妥酸顯色法、硝酸還原酶法和黃嘌呤氧化酶法分別測(cè)定細(xì)胞MDA,NO含量和SOD活性。2.550.50ldh釋放量的測(cè)量復(fù)氧2h后,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按試劑盒說(shuō)明操作,用2,4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定LDH釋放量。2.6細(xì)胞裂解液的制備參照文獻(xiàn)方法,將收集的細(xì)胞離心沉淀,吸干水分后,加入150μL冰冷的細(xì)胞裂解液于冰上勻漿,冰浴30min;4℃下12000×g離心10min;取上清(含胞膜和胞漿裂解物)置于4℃預(yù)冷的Ep管中,液氮速凍,-70℃保存?zhèn)溆?。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白濃度。2.7分離蛋白的制備取細(xì)胞裂解液上清,分別加入5×上樣緩沖液于沸水浴中加熱5min后離心,加入已灌制好的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,每泳道上樣40μg;電泳結(jié)束,將分離蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜;TBST洗膜,隨后將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中,室溫封閉1h,然后用一抗工作液孵育,4℃過(guò)夜(16~18h);TBST充分洗膜后,用HRP標(biāo)記二抗工作液37℃孵膜;TBST洗膜,將膜移入ECL工作液中,顯影,壓片,用Quantityone4.5.1版圖像分析軟件(Bio-Rad公司產(chǎn)品)分析條帶的吸光度,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量,試驗(yàn)重復(fù)3次。3結(jié)果3.1各組葵、魚(yú)、葛凍干粉的比較缺氧/復(fù)氧后,模型組A低于對(duì)照組(P<0.05);與模型組比較,12.5mg·L-1的梓葛凍干粉顯著高于模型組(P<0.05);49.0,24.5mg·L-1梓葛凍干粉組與模型組相比沒(méi)有顯著性差異。3.2尼莫地平-1和學(xué)習(xí)葵、腈葛凍干粉治療mda的活性缺氧/復(fù)氧損傷后,模型組MDA和NO含量以及LDH釋放量均顯著性升高(P<0.05),SOD活性顯著性降低(P<0.05)。藥物干預(yù)后,尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛凍干粉24.5,12.5mg·L-1能顯著降低MDA,LDH和NO含量(P<0.05);尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛凍干粉的各劑量均能顯著提高SOD活性(P<0.05)(表1)。3.3caspase-3和bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Westernblot結(jié)果顯示,缺氧/復(fù)氧損失后,Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降,Bcl-2/Bax顯著降低(P<0.01);藥物干預(yù)后,尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛凍干粉49.0,24.5mg·L-1組Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.01);尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛凍干粉24.5,12.5mg·L-1組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01);同時(shí),尼莫地平2.1mg·L-1和梓葛凍干粉49.0,24.5,12.5mg·L-1顯著降低Bax蛋白的表達(dá)并上調(diào)Bcl-2/Bax(P<0.05,P<0.01)(表2,圖1)。4同型：葛凍干粉對(duì)huvd活性的影響腦缺血再灌注損傷時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞受損可使內(nèi)皮依賴(lài)性舒張血管的物質(zhì)(如NO)生成減少,加速腦缺血性損傷。Yang等研究發(fā)現(xiàn)CYP4502J2過(guò)表達(dá)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,可拮抗缺氧/復(fù)氧損傷。梓葛凍干粉是否通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞拮抗腦缺血/再灌注損傷值得探討。近年研究發(fā)現(xiàn),梓醇能夠阻止線粒體膜電位的喪失,提高內(nèi)源性抗氧化能力,降低自由基生成,從而抑制多巴胺神經(jīng)元損傷。葛根素對(duì)小鼠的缺氧損傷具有顯著延長(zhǎng)存活時(shí)間的作用,以及對(duì)小鼠缺氧后再暴露所引起的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生也有顯著的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中缺氧/復(fù)氧后,LDH釋放量顯著增加,A降低,證實(shí)缺氧/復(fù)氧造成HUVECs損傷。本研究觀察了MDA,NO及SOD水平,結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧引起細(xì)胞MDA和NO含量升高(P<0.05),SOD活性下降(P<0.05),表明自由基大量產(chǎn)生與缺氧/復(fù)氧損傷有關(guān)。給予梓葛凍干粉后,LDH釋放量,MDA和NO含量顯著降低,細(xì)胞活力提高,SOD活性顯著提高,提示梓葛凍干粉通過(guò)提高缺氧/復(fù)氧狀態(tài)下HUVECs的SOD活性,進(jìn)而減少缺氧/缺氧引起的氧自由基增多而起到保護(hù)作用。梓葛凍干粉對(duì)HUVECs的保護(hù)作用通過(guò)哪些信號(hào)途徑尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),缺血/再灌注損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。除嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致部分細(xì)胞壞死外,壞死灶周邊細(xì)胞及慢性缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞大部分是以凋亡方式死亡。Anuradha等發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的保護(hù)作用是通過(guò)維護(hù)線粒體跨膜壓、拮抗Caspase-3激活和上調(diào)Bcl-2實(shí)現(xiàn)的。相關(guān)研究表明,葛根素能通過(guò)降低Caspase-3蛋白的表達(dá)水平,增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)水平,上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax等,實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究觀察了梓葛凍干粉對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷HUVECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,藥物干預(yù)后,梓葛凍干粉顯著提高缺氧/復(fù)氧組Bcl-2蛋白的表達(dá),降低Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá),并上調(diào)Bcl-2/Bax,表明梓葛凍干粉可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力,從而