色譜分離技術(shù)-凝膠色譜分離技術(shù)

凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介基本原理1凝膠色譜的特點(diǎn)2凝膠過(guò)濾色譜又稱分子篩或排阻色譜。

以各種多孔凝膠為固定相，根據(jù)溶液中各組分相對(duì)分子質(zhì)量（分子大小）差異而分離的一種液相色譜技術(shù)。凝膠顆粒是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介基本原理利用凝膠對(duì)大小不同的分子流動(dòng)產(chǎn)生的阻滯作用不同而分離的色譜方法。凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介基本原理

凝膠色譜分離技術(shù)大分子物質(zhì)

直徑較大→不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔→流程短→先流出小分子物質(zhì)

直徑較小→能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔→流程長(zhǎng)→后流出中等大小分子物質(zhì)

直徑居中→介于二者之間

特點(diǎn)凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介凝膠過(guò)濾色譜法的優(yōu)點(diǎn)1.操作簡(jiǎn)單易行，凝膠不用再生、可反復(fù)使用，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。2.凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物。3.洗脫容易，分離條件緩和。4.分離效果好，重復(fù)性高。5.應(yīng)用范圍廣，分離分子量的覆蓋面大。

特點(diǎn)凝膠色譜分離技術(shù)簡(jiǎn)介凝膠過(guò)濾色譜法的缺點(diǎn)1.處理量小。2.分辨率不高。3.分離速度較慢。4.4凝膠色譜分離技術(shù)4.色譜分離技術(shù)基本原理1凝膠色譜法的特點(diǎn)2凝膠過(guò)濾介質(zhì)3凝膠色譜法的操作方法4凝膠色譜法的應(yīng)用5凝膠色譜分離技術(shù)凝膠過(guò)濾色譜又稱分子篩或排阻色譜。

以各種多孔凝膠為固定相，根據(jù)溶液中各組分相對(duì)分子質(zhì)量（分子大?。┎町惗蛛x的一種液相色譜技術(shù)。凝膠顆粒是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。凝膠色譜分離技術(shù)利用凝膠對(duì)大小不同的分子流動(dòng)產(chǎn)生的阻滯作用不同而分離的色譜方法?；驹砘驹泶蠓肿游镔|(zhì)

直徑較大→不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔→流程短→先流出小分子物質(zhì)

直徑較小→能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔→流程長(zhǎng)→后流出中等大小分子物質(zhì)

直徑居中→介于二者之間凝膠色譜法的特點(diǎn)凝膠色譜法的優(yōu)點(diǎn)1.操作簡(jiǎn)單易行，凝膠不用再生、可反復(fù)使用，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。2.凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物。3.洗脫容易，分離條件緩和。4.分離效果好，重復(fù)性高。5.應(yīng)用范圍廣，分離分子量的覆蓋面大。凝膠色譜法的特點(diǎn)凝膠色譜法的缺點(diǎn)1.處理量小。2.分辨率不高。3.分離速度較慢。理想的凝膠過(guò)濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿，具有高化學(xué)惰性，內(nèi)孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。

目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠過(guò)濾介質(zhì)的共性常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)凝膠，商品名為Sephadex。

它由葡聚糖Dextran與環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。凝膠過(guò)濾介質(zhì)葡聚糖凝膠的特點(diǎn)1.葡聚糖凝膠Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹。2.Sephadex在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100℃下40min對(duì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒(méi)有明顯的影響。3.Sephadex含有羥基基團(tuán)，呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(tuán)（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。4.在鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中比較穩(wěn)定。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠來(lái)源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是由D-半乳糖和3,6-脫水半乳糖交替以氫鍵交聯(lián)而成。其商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見(jiàn)的主要有Sepharose（2B-6B）和Bio-gelA。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

瓊脂糖凝膠與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4～9，溫度0～30℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，商品名為Bio-GelP。

主要型號(hào)有Bio-GelP-2~Bio-GelP-300等10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的特點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于葡聚糖凝膠，其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好，洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來(lái)，在pH1~10范圍穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，所以吸附效應(yīng)較小。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)疏水性凝膠

常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號(hào)，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40000000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好。凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)（一）凝膠的選擇凝膠的選擇依據(jù)：1.分離范圍；2.分辨率；3.穩(wěn)定性。如制備分離中的脫鹽，大多采用硬膠，既容易操作，又可得到滿意的流速，常用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25、G-50。對(duì)于小肽和低分子量物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可采用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-10、G-15及生物凝膠P-2、P-4。凝膠色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

1.葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠

以干品出售的，所以使用前必須溶脹。溶脹必須徹底，若溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果，甚至有使柱破裂的危險(xiǎn)。

溶脹方法：在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過(guò)細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。凝膠色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以濃懸浮液的形式出售的，因此不須溶脹。瓊脂糖凝膠的正常操作溫度是0-30℃，高于36℃時(shí)，這種凝膠就要軟化解體。凝膠色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。

分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。層析柱越長(zhǎng)，分辨率越高。凝膠色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇從大分子（M.W.>20000）中分離小分子，如無(wú)機(jī)鹽或代謝中間物（M.W.<1500）時(shí)，柱床體積應(yīng)是上樣體積的4-10倍，柱高：柱直徑應(yīng)為5:1-15:1。這類(lèi)柱叫除鹽柱。

分離大分子時(shí)，柱床體積應(yīng)為上樣體積的25-100倍，柱高：柱直徑應(yīng)為20:1-100:1。直徑小于1cm的柱，在濕潤(rùn)的玻璃柱壁上有“壁效應(yīng)”，能?chē)?yán)重降低柱的分辨率。凝膠色譜法的操作方法（四）凝膠柱的裝填1.空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。2.所用凝膠必須是經(jīng)過(guò)充分溶漲的。3.開(kāi)始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開(kāi)柱端閥門(mén)并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對(duì)分離不利。4.進(jìn)膠過(guò)程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。5.凝膠懸液濃度也需控制，過(guò)稀和過(guò)濃都會(huì)產(chǎn)生不利影響。凝膠色譜法的操作方法（五）樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)。(1)直接將樣品加到層析床表面；(2)利用兩種液體相對(duì)密度不同而分層。凝膠色譜法的操作方法（六）洗脫與收集當(dāng)樣品液恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，由不致使凝膠床面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫。為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過(guò)程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。凝膠色譜法的操作方法（七）凝膠的再生和保養(yǎng)因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，所以一次分離后無(wú)須再生處理就可以進(jìn)行下一次分離。一般的層析床可反復(fù)使用數(shù)十次。

交聯(lián)葡聚糖凝膠柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液處理，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用0.5mol/LNaCl處理。凝膠色譜法的操作方法1.脫鹽及去除小分子雜質(zhì)和溶液的濃縮2.分離生物大分子物質(zhì)3.去除熱原物質(zhì)4.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量凝膠色譜法的應(yīng)用凝膠色譜分離技術(shù)

——操作與應(yīng)用凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法1凝膠過(guò)濾色譜法的應(yīng)用2（一）凝膠的選擇凝膠的選擇依據(jù)：1.分離范圍；2.分辨率；3.穩(wěn)定性。如制備分離中的脫鹽，大多采用硬膠，既容易操作，又可得到滿意的流速，常用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25、G-50。對(duì)于小肽和低分子量物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可采用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-10、G-15及生物凝膠P-2、P-4。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

1.葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠

以干品出售的，所以使用前必須溶脹。溶脹必須徹底，若溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果，甚至有使柱破裂的危險(xiǎn)。

溶脹方法：在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過(guò)細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以濃懸浮液的形式出售的，因此不須溶脹。瓊脂糖凝膠的正常操作溫度是0-30℃，高于36℃時(shí)，這種凝膠就要軟化解體。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。

分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。層析柱越長(zhǎng)，分辨率越高。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇從大分子（M.W.>20000）中分離小分子，如無(wú)機(jī)鹽或代謝中間物（M.W.<1500）時(shí)，柱床體積應(yīng)是上樣體積的4-10倍，柱高：柱直徑應(yīng)為5:1-15:1。這類(lèi)柱叫除鹽柱。

分離大分子時(shí)，柱床體積應(yīng)為上樣體積的25-100倍，柱高：柱直徑應(yīng)為20:1-100:1。直徑小于1cm的柱，在濕潤(rùn)的玻璃柱壁上有“壁效應(yīng)”，能?chē)?yán)重降低柱的分辨率。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（四）凝膠柱的裝填1.空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。2.所用凝膠必須是經(jīng)過(guò)充分溶漲的。3.開(kāi)始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開(kāi)柱端閥門(mén)并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對(duì)分離不利。4.進(jìn)膠過(guò)程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。5.凝膠懸液濃度也需控制，過(guò)稀和過(guò)濃都會(huì)產(chǎn)生不利影響。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（五）樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)。(1)直接將樣品加到層析床表面；(2)利用兩種液體相對(duì)密度不同而分層。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（六）洗脫與收集當(dāng)樣品液恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，由不致使凝膠床面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫。為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過(guò)程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法（七）凝膠的再生和保養(yǎng)因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，所以一次分離后無(wú)須再生處理就可以進(jìn)行下一次分離。一般的層析床可反復(fù)使用數(shù)十次。

交聯(lián)葡聚糖凝膠柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液處理，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用0.5mol/LNaCl處理。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的操作方法1.脫鹽及去除小分子雜質(zhì)和溶液的濃縮2.分離生物大分子物質(zhì)3.去除熱原物質(zhì)4.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法的應(yīng)用凝膠色譜分離技術(shù)

——凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠過(guò)濾介質(zhì)的共性1常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)2理想的凝膠過(guò)濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿，具有高化學(xué)惰性，內(nèi)孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。

目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠過(guò)濾介質(zhì)的共性凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)凝膠，商品名為Sephadex。

它由葡聚糖Dextran與環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)葡聚糖凝膠的特點(diǎn)1.葡聚糖凝膠Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹。2.Sephadex在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100℃下40min對(duì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒(méi)有明顯的影響。3.Sephadex含有羥基基團(tuán)，呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(tuán)（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。4.在鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中比較穩(wěn)定。凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠來(lái)源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是由D-半乳糖和3,6-脫水半乳糖交替以氫鍵交聯(lián)而成。其商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見(jiàn)的主要有Sepharose（2B-6B）和Bio-gelA。凝膠色譜分離技術(shù)——凝膠過(guò)濾介質(zhì)常用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

瓊脂糖凝膠與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4～