表皮生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病大鼠傷口愈合的影響

表皮生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病大鼠傷口愈合的影響

為了研究外源性生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病難治傷口愈合的影響機(jī)制，一直是近年來(lái)傷口愈合研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在本研究中，我們使用了糖尿病大鼠背部病變模型，比較了治療組和對(duì)照組之間的傷口損傷能力，并確定了egf對(duì)傷口成纖維細(xì)胞的復(fù)制機(jī)制。對(duì)于前膠原原（i）的mrna水平，我們對(duì)egf在難治傷口中的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。材料和方法1氧吡啶致傷方法健康雄性SD大鼠40只,體重200~250g,隨機(jī)分為正常組(n=12)、糖尿病組(n=28)。正常組大鼠腹腔注射1.5ml生理鹽水,糖尿病組大鼠腹腔注射新鮮配制四氧嘧啶(1.5mg/10g體重),測(cè)得血糖值大于10mmol/L(1800mg/L),并維持2天后,即可致傷。致傷在無(wú)菌條件下進(jìn)行,大鼠麻醉、脫毛后,沿脊椎方向用外科方法做兩條深達(dá)筋膜長(zhǎng)約4cm的平行切口,傷口距脊椎垂直距約為1cm,縫合傷口。在糖尿病治療組切口傷基底處注入20μl100U/ml的EGF液,糖尿病自身對(duì)照組及正常組傷口基底注入20μl牛血清白蛋白(5mg/ml)液。2fps測(cè)定參照文獻(xiàn)。生長(zhǎng)融合的傷口成纖維細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰酶消化,1640液洗滌,用1640/1%FCS培養(yǎng)液將細(xì)胞團(tuán)調(diào)成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,點(diǎn)接細(xì)胞懸液100μl到96孔培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2條件下孵育12小時(shí),細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),吸去培養(yǎng)液,對(duì)照組加入1640/5%FCS100μl,EGF組加入100μl100U/mlEGF、1%FCS1640液與細(xì)胞孵育48小時(shí)后,每孔培養(yǎng)皿中加入10μlMTT(5mg/ml),37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),再加入100μl10%SDS,37℃保溫18小時(shí)后,在酶標(biāo)儀(Bio-Rad450型)570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔溶液的光吸收值,兩種待測(cè)液平行測(cè)定6個(gè)樣品。3細(xì)胞中總rna提取待傷口修復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)融合后,用Hank’s液洗2次,對(duì)照組加入20μl含1%FCS1640液,EGF組加入20μl100U/mlEGF、1%FCS1640液,37℃,5%CO2條件下孵育0.5、4、8、12小時(shí)后,取出培養(yǎng)細(xì)胞,每一時(shí)相點(diǎn)每組細(xì)胞總數(shù)大于1×107/ml,按TotalRNAIsolatiomKit標(biāo)準(zhǔn)程序提取細(xì)胞中的總RNA,260nm、280nm定量,檢測(cè)純度后,-20℃保存。前膠原Ⅰ型(α1)1.8kbcDNA片段來(lái)源于質(zhì)粒Hf677EcoRI酶切位點(diǎn),用隨機(jī)引物法將α-32P-dCTP摻入到探針中,標(biāo)記產(chǎn)物比活度大于1×109/ngDNA。用真空加樣器將對(duì)照組、EGF治療組細(xì)胞總RNA各20μg點(diǎn)接到尼龍膜(Boehringer,Germany)上,同一組別平行點(diǎn)接2個(gè)樣品,80℃真空干燥2小時(shí),裝入雜交袋中。按《分子克隆指南》標(biāo)準(zhǔn)程序行斑點(diǎn)雜交及放射自顯影,顯影膠片用計(jì)算機(jī)定量掃描處理。4大鼠口服抗張力測(cè)定傷后7、10、14天,分別從正常組、糖尿病組中隨機(jī)選取大鼠4~8只活殺,沿傷口垂直方向剪取傷口中央段1cm寬皮條,在張力儀上測(cè)定傷口抗張力值。結(jié)果1egf對(duì)傷口纖維細(xì)胞的克隆作用EGF組光密度值為(0.351±0.097),顯著高于對(duì)照組(0.213±0.063),EGF能促進(jìn)傷口成纖維細(xì)胞的增殖。2egf對(duì)傷口前膠原細(xì)胞前膠原基因的發(fā)現(xiàn)的影響按每微克總RNA對(duì)應(yīng)的掃描相數(shù)值比較EGF作用不同時(shí)間后傷口成纖維細(xì)胞前膠元Ⅰ(α1)mRNA水平量,比較結(jié)果見附圖。3治療組和對(duì)照組在受傷后的抗破裂能力之間的比較傷后不同天數(shù)各組傷口抗張力值見附表。從附表可見,糖尿病治療組與正常組和糖尿病自身對(duì)照組比較差異非常顯著(P<0.01)。egf基因調(diào)控規(guī)律糖尿病傷口愈合遲緩是臨床上常見的難題,其有關(guān)機(jī)理尚不完全清楚,傷口愈合過(guò)程表現(xiàn)為修復(fù)細(xì)胞的遷移、聚集、增殖、分化、血管再生及膠元合成等。文獻(xiàn)報(bào)道,糖尿病或正常小鼠皮膚中生長(zhǎng)因子的含量無(wú)差異,但致傷后正常小鼠傷口中EGF、FGF等生長(zhǎng)因子的峰值水平及mRNA轉(zhuǎn)錄明顯早于難愈性傷口。有關(guān)研究人員觀察到糖尿病小鼠傷口處多種細(xì)胞因子PDGF、EGF、bFGF、aFGF的基因調(diào)控規(guī)律異于正常小鼠傷口愈合中的調(diào)控規(guī)律,表達(dá)時(shí)間延遲,表達(dá)強(qiáng)度下降。補(bǔ)充外源性生長(zhǎng)因子如aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、EGF/胰島素,可明顯改善糖尿病傷口愈合多項(xiàng)參數(shù)。已在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)EGF可直接促進(jìn)傷口修復(fù)細(xì)胞的生長(zhǎng),EGF是否可直接刺激修復(fù)細(xì)胞表達(dá)膠原Ⅰ型基因,還未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)EGF對(duì)傷口成纖維細(xì)胞有明顯的增殖作用,并促進(jìn)成纖維細(xì)胞中膠元Ⅰ(α1)基因表達(dá)。皮膚切口傷傷口愈合程度直接取決于跨越沉積到傷口邊緣處的Ⅰ型膠元(α1)合成量,且傷口肉芽組織膠元合成發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平,膠原基因表達(dá)受阻可因傷口肉芽組織中表達(dá)基因的細(xì)胞數(shù)目減少和表達(dá)強(qiáng)度降