松胞素阻滯微核法預(yù)測鼻咽癌放射敏感性

松胞素阻滯微核法預(yù)測鼻咽癌放射敏感性

輻射敏感性意味著所有輻射條件都是嚴(yán)格一致的。在所有輻射條件下，身體、器官和組織的輻射反應(yīng)能力或速度和速度不同。如果反應(yīng)強烈，速度快，敏感高。放射敏感性從放射生物學(xué)的角度定義為能夠造成細(xì)胞DNA雙鏈斷裂所需的輻射劑量多少的性質(zhì)。因此,在相同輻射劑量照射下,若射線產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂數(shù)量越多,DNA損傷修復(fù)能力越低,染色體損傷越嚴(yán)重,放射敏感性也就越高。松胞素阻滯微核法(cytokinesis-blockmicronucleusassay,CBMNA)最早在1986年由Fenech等報道,在體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞時,加入一種微管蛋白聚集抑制劑——松胞素B,可抑制胞質(zhì)運動而不影響細(xì)胞核的分裂,出現(xiàn)雙核淋巴細(xì)胞,其內(nèi)出現(xiàn)的微核代表了第1次核分裂時的染色體斷裂或缺失,因此,檢測微核率及微核細(xì)胞率可反映細(xì)胞受射線照射后染色體損傷程度。本研究采用松胞素阻滯微核法檢測鼻咽高分化鱗癌細(xì)胞株CNE1和低分化鱗癌細(xì)胞株CNE2放射敏感性,并與經(jīng)典的克隆形成法比較,以了解松胞素阻滯微核法在鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性檢測上的可行性。1材料和方法1.1hsb、野生型菌株鼻咽高分化鱗癌細(xì)胞株CNE1及鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株CNE2由中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗研究部夏云飛教授惠贈。胎牛血清由杭州四季青生物材料有限公司提供。松胞素B、吉姆薩粉為美國Sigma公司產(chǎn)品,F34-1型深部X線機由北京東方紅醫(yī)療器械廠生產(chǎn),甲醇、丙醋酸和甘油等均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。1.2照射線密度的確定取對數(shù)生長期的CNE1及CNE2細(xì)胞,用胰酶消化,調(diào)節(jié)CNE1及CNE2細(xì)胞數(shù)濃度至5×104mL-1,按梯度倍數(shù)稀釋法將102～105的細(xì)胞數(shù)分別移入各劑量組直徑6cm的培養(yǎng)皿,加入培養(yǎng)液使培養(yǎng)皿內(nèi)液體總量5mL,每個劑量設(shè)4個平行樣本。深部X線機照射0、0.5、1、2、4、6和8Gy,條件為210kV、12mA和0.52mmCu,劑量率0.966Gy/min,限光筒大小為10cm×15cm,把需照射區(qū)域置于射野中心。照射后的CNE1、CNE2培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)10～14d后,肉眼可見克隆形成,倒置顯微鏡下可見>50個細(xì)胞的集落形成。中止培養(yǎng),移去培養(yǎng)液,用PBS清洗2次,每皿加入2mL甲醇固定15min,移去固定液,空氣干燥,每孔加入10%吉姆薩工作液2mL20min染色,燈箱下計數(shù)每個培養(yǎng)皿中的集落數(shù),多于50個細(xì)胞數(shù)為1個集落,計算每組均值。1.3細(xì)胞培養(yǎng)和檢測每個劑量設(shè)2個平行樣本,每6孔板孔接種2×105細(xì)胞,每孔加入10%胎牛血清1640培養(yǎng)液2mL,24h后細(xì)胞貼壁。用深部X線機照射0、0.5、1、2、4、6和8Gy,條件為210kV、12mA和0.52mmCu,劑量率0.966Gy/min,限光筒大小為10cm×15cm,把需照射區(qū)域置于射野中心,不需照射區(qū)域用鉛塊遮擋。移去原培養(yǎng)液,用PBS清洗2次,每孔加入含2μg/mL松胞素B的10%胎牛血清培養(yǎng)液2mL,移入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,36h后顯微鏡下觀察有較多的雙核細(xì)胞。中止培養(yǎng),移去培養(yǎng)液,用PBS清洗2次,每孔加入2mL甲醇丙醋酸混合液,濃度為3∶1(按體積比配制)固定20min,移去固定液,空氣干燥,每孔加入10%吉姆薩工作液2mL20min染色。400倍鏡下按順序觀察1000個雙核細(xì)胞,全孔不足1000個雙核細(xì)胞時按可計數(shù)的全部雙核細(xì)胞數(shù)觀察。微核標(biāo)準(zhǔn):位于主核大小一致的雙核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),核膜獨立或條帶(核漿橋)相連;微核直徑是主核的1/16～1/3,面積是主核的1/256～1/9;圓形或卵圓形,染色與主核相同,可與主核分開;無折光性,可與偽影分開。微核細(xì)胞率(micronucleatedcellfrequency,MNCF)為有微核的雙核細(xì)胞數(shù)占總雙核細(xì)胞數(shù)的比率,微核率(micronucleusfrequency,MNF)為微核總數(shù)占總雙核細(xì)胞數(shù)的比率。松胞素阻滯增殖指數(shù)(cytokinesis-blockproliferationindex,CBPI)=[1M1+2M2+3(M3+M4)]/N,M1、M2、M3和M4指1～4核的細(xì)胞數(shù),N為總的細(xì)胞數(shù),400倍下隨機計數(shù)500活的腫瘤細(xì)胞。1.4指標(biāo)間關(guān)系及分析用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行結(jié)果分析。照射劑量與存活分?jǐn)?shù)、MNF、MNCF、CBPI間關(guān)系、存活分?jǐn)?shù)與MNF、MNCF間關(guān)系采用曲線擬合,CNE1、CNE2同一劑量間MNF、MNCF差異采用Fisher精確概率法χ2檢驗。指標(biāo)間分析采用相關(guān)分析。差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P≤0.05。2結(jié)果2.1次模型擬合克隆形成法結(jié)果見表1及圖1。從表1可以看出,在≥2Gy劑量照射時,CNE2存活分?jǐn)?shù)明顯比CNE1低,P<0.01。線性二次模型公式為S=e-(αd+βd2),可推知-ln(S)=αd+βd2,用SPSS二次模型曲線擬合,結(jié)果見表2?？梢?CNE2的α值、α/β值較CNE1高,SF2觀察值及擬合值均較CNE1低。2.2比較e的mnf、mnpfCNE1和CNE2松胞素阻滯微核法結(jié)果見表3。從表3可以看出,CNE1、CNE2的MNF和MNCF在照射劑量0、0.5Gy時,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;但在≥1Gy劑量照射時,CNE2的MNF、MNCF明顯比CNE1大。對CNE1、CNE2的MNF和MNCF與照射劑量間行曲線擬合分析,結(jié)果呈線性正相關(guān),公式如下。CNE1:y(MNF)=0.0168+0.0408dy(MNCF)=0.0196+0.0328dCNE2:y(MNF)=0.0289+0.0603dy(MNCF)=0.0314+0.0459d可見CNE2斜率明顯較CNE1斜率大。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),CBPI與劑量顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.934,P<0.01,即隨劑量增加,CNE1、CNE2的CBPI明顯減小,增殖受抑制。2.3線性模型擬合CNE1、CNE2的SF與MNF、MNCF進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),SF與MNF(相關(guān)系數(shù)-0.752)、SF與MNCF(相關(guān)系數(shù)-0.791)明顯負(fù)相關(guān),P<0.01。先對SF轉(zhuǎn)換成-ln(SF),再與MNF、MNCF進(jìn)行線性模型擬合、線性二次模型擬合,見二次模型擬合滿意,公式如下。CNE1:Y=-0.0127+1.4077X+55.8911X2(X為MNF,Y為-ln(SF))Y=-0.0374-0.9563X+93.8841X2(X為MNCF,Y為-ln(SF))CNE2:Y=-0.0062+1.3084X+42.7339X2(X為MNF,Y為-ln(SF))Y=0.2736-7.4506X+95.9565X2(X為MNCF,Y為-ln(SF))可見,隨著照射劑量的增加,SF下降,MNF、MNCF增加,兩者的趨勢一致。CNE1、CNE2內(nèi)的典型微核見圖2。3微核試驗和克隆形成法的比較從表1可以看出,盡管照射劑量在0、0.5和1Gy時,CNE1、CNE2存活分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P>0.05,但照射劑量在≥2Gy時,CNE2存活分?jǐn)?shù)明顯比CNE1低,P<0.01,即在常規(guī)分割照射2Gy時,兩者的放射敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對細(xì)胞存活曲線擬合主要有線性二次模型、單擊多靶模型等,以線性二次模型應(yīng)用最為廣泛、最為可靠。線性二次模型有α、β兩個參數(shù)。α值代表細(xì)胞存活曲線的初始斜率,決定低劑量照射下放射損傷的程度,與細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),CNE2的α值(0.4535)是CNE1的α值(0.1147)的4倍,也確認(rèn)CNE2的放射敏感性比CNE1高,與放射敏感性與分化程度成反比的B-T法則一致。腫瘤組織CBMNA是研究射線照射腫瘤組織后,腫瘤細(xì)胞第1次核分裂時出現(xiàn)的雙核細(xì)胞(本研究選擇照射CNE1、CNE236h后終止培養(yǎng),此時得到較多的雙核細(xì)胞,較少的3核、4核細(xì)胞)對射線損傷反應(yīng)情況。由于染色體的不均勻分配或斷裂缺失使腫瘤細(xì)胞無法完成進(jìn)一步的增殖而死亡,因此,染色體畸變程度與細(xì)胞殺滅是最有相關(guān)性的指標(biāo)。Fenech等用外周血淋巴細(xì)胞檢測不同葉酸濃度對染色體損傷情況發(fā)現(xiàn),微核細(xì)胞率、核漿橋率和核芽率均非常敏感地檢測出染色體損傷(P<0.001),三者結(jié)果完全一致。與核漿橋、核芽相比,雙核細(xì)胞中的微核更易辨認(rèn),故國內(nèi)外大多數(shù)研究及本研究都只選擇計數(shù)微核,分析微核率及微核細(xì)胞率。CNE1、CNE2的MNF和MNCF在照射劑量0、0.5Gy時差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P>0.05,說明放療前自發(fā)性微核率、0.5Gy小劑量照射下誘發(fā)的微核率在CNE1和CNE2間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;但在≥1Gy劑量照射時,兩細(xì)胞株間差異明顯。CBMNA的MNF和MNCF在外照射1Gy時即檢測出了CNE1和CNE2染色體損傷差異,比克隆形成法還要敏感(后者在外照射2Gy時才檢測出CNE1和CNE2存活分?jǐn)?shù)差異)。本研究還發(fā)現(xiàn),隨劑量增加,MNF、MNCF隨之增加,兩者呈線性正相關(guān),與羅加林等、王菊芳等和Champion等對細(xì)胞株檢測結(jié)果一致,提示隨著照射劑量的增加,射線造成DNA單鏈及雙鏈斷裂隨之增多,染色體損傷線性增加,這與Cao等提出CBMNA為檢測染色體損傷最敏感方法一致。由于本研究的克隆形成法與CBMNA的外照射劑量完全相同,故對CNE1、CNE2的存活分?jǐn)?shù)SF與MNF、MNCF的相關(guān)性進(jìn)行分析較為可靠,CNE1、CNE2的SF與MNF、MNCF進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),SF與MNF、SF與MNCF明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)。隨著照射劑量的增加,MNF、MNCF增加,-ln(SF)增加