山東大學醫(yī)學院

成績:山東大學醫(yī)學院機能學實驗設(shè)計題 目:艾葉油對離體豚鼠氣管平滑肌的影響設(shè)計人員及學號：侯毅 20052303023 姜林2005230303金自慧20052303030 孔瓏2005230303專業(yè)：臨床醫(yī)學七年制班級：05級3班聯(lián)系電話:金自慧侯毅:832542008年6月2日立題依據(jù)(主要說明本研究的目的、意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及主要參考文獻)艾葉為菊科艾莫Artemisiaargrilevi.etVant.的干燥葉，祖國醫(yī)學將艾葉歸類為法寒藥，具溫經(jīng)止血，散寒除濕之功效。很少有艾葉用于哮喘的描述，僅在《本草匯言》有記載:"艾葉，暖血溫經(jīng)，行氣開郁之藥也。若氣血、痰飲、積聚為病，哮喘逆氣，骨蒸痞結(jié)，癱瘓痛瘟等疾，灸之立起沉礙。"［1］。民間還用此治療喘鳴、痰飲、咳嗽等問。本世紀60年代才有艾葉煎劑治療慢性氣管炎或肺結(jié)核喘息癥狀的報道。70年代用蒸館法提取艾葉泊，制成膠丸或糖衣片治療慢性氣管炎或哮喘。70年代藥理研究發(fā)現(xiàn)艾葉油具有平喘作用，之后又對艾葉泊的低中高沸點部位進行了藥理篩選，發(fā)現(xiàn)了中沸點部位具有較強的鎮(zhèn)咳、法痰、平喘作用。80年代實驗室曾經(jīng)對艾葉泊中分離的幾個主要單體a蔽品烯醇刃、葛縷醇［4］、a2丁香烯醇［5］等進行了平喘作用及機制的研究，結(jié)果表明它們均有較強的平喘和抗過敏作用，其作用機制與升高氣道平滑肌cAMP水平和降低cGMP水平，抑制過敏介質(zhì)釋放，拮抗過敏介質(zhì)作用，抑制肥大細胞釋放介質(zhì)，抑制氣管平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流等有關(guān)。90年代末實驗室還證明了艾葉油能抑制致敏豚鼠氣管Schultz2Dale反應，降低組膠或氨甲歌膽堿引起的豚鼠氣管收縮pD2值，抑制大鼠被動皮膚過敏反應以及52楚色膠引起的大鼠皮膚毛細血管通透性增強反應，抑制豚鼠肺組織釋放過敏性慢反應物質(zhì)(SRS2A)，拮抗SRS2A對豚鼠回腸的收縮［6］。艾葉油及其主要成份均不引起豚鼠離體心臟收縮幅度增大和頻率加快，在離體氣管平滑肌試驗中，用艾葉泊或其主要成份反復處理，不會產(chǎn)生耐受性反應。由于不通過。2腎上腺素能激動產(chǎn)生支氣管平滑肌擴張作用，因此沒有a2腎上腺素能激動劑樣心率加快及骨髓肌震顫等不良反應。經(jīng)長期臨床應用，不良反應報道甚少，因此是一個安全有效的哮喘和慢性氣管炎治療藥物［7］。本實驗對艾葉泊對正常離體豚鼠氣管的擴張作用及對組織膠、乙酷膽堿和抗原誘發(fā)的離體氣管平滑肌痊孿的保護作用的藥效作了實驗研究。通過實驗驗證了艾葉泊的平喘作用，為艾葉泊治療各種因素引起的氣管支氣管痊孿提供實驗數(shù)據(jù)支持。實驗還將成為下一步研究艾葉泊對支氣管作用的各種性質(zhì)及特點提供實驗思路和基本數(shù)據(jù)，例如本實驗所得數(shù)據(jù)作可為研究支氣管對艾葉泊耐受性大小的數(shù)據(jù)，己證實艾葉泊較少引起耐受。因此本實驗可以成為整個一系列艾葉泊藥效藥動研究實驗中的基礎(chǔ)實驗之一。艾葉油作為中藥提取物，臨床應用有許多祖國醫(yī)學的優(yōu)點。同時通過己有實驗已證實艾葉油不通過02腎上腺素受體激動產(chǎn)生支氣管平滑肌擴張作用，因此沒有02腎上腺素能激動劑樣心率加快及骨髓肌震顫等不良反應，因此本實驗對今后艾葉油臨床的應用提供了實驗室支持。實驗目的:觀察州對正常時時平滑陽用叫膠乙附和抗原誘發(fā)的離體氣管平滑肌痊孿的作用實驗原理:氣管平滑肌上主要分布有M膽堿受體、HI組膠受體和°腎上腺素受體。當M受體和HI受體興奮時，氣管平滑肌收縮，可以導致哮喘:而當°受體興奮時，氣管平滑肌松弛，可以緩解哮喘。根據(jù)用藥后長生的效應，可篩選具有平喘作用的藥物。豚鼠氣管對藥物的反應較敏感，故常選用。艾葉泊具有一定擴張支氣管作用。艾葉油對抗原、乙酷膽堿和組織膠誘發(fā)的氣管平滑肌痊孿和哮喘也有一定保護作用。離體氣管螺旋條可以模擬出痊孿與解痊效果且利于觀察5通過利用卵蛋白做抗原可以建立哮喘模型，借助EL41(系統(tǒng)可以觀察和探討艾葉油解除支氣管平滑肌痊孿作用及其效果。參考文獻1中華人民共和國藥典委員會編?中華人民共和國藥典?天津天津科技翻譯出版社，2((6.682蔡平，艾葉的藥理作用及應用，時珍國醫(yī)國藥，200112(12)1137-1131如漉，周漢良，謝強敏，等?新平喘藥a2蔽品烯醇的藥理作用?中國藥理學通報，19873(曰：323.報，198817(3):115.唐法姊，下如漉，謝強敏，等.a2丁香烯醇的藥理研究?中國藥理學通報，1991，7(2):145.謝強敏，唐法姊，下如漉等.艾葉泊的呼吸系統(tǒng)藥理研究-II，抗過敏作用.中國現(xiàn)代應用藥學雜志1999，16(曰:3謝強敏，下如濺，楊秋火，等?艾葉泊的呼吸系統(tǒng)藥理研究一I，支氣管擴張、鎮(zhèn)咳和法痰作用.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，1999，16(4):16.武捷?清熱散結(jié)片對豚鼠支氣管平滑肌的影響?黑龍江醫(yī)藥2007,20(0：520張玉祥，曾曉會，周瑞玲等?花椒超臨界萃取物對豚鼠離體氣管活動的影響?中藥新藥與臨床藥理2006，17（1）:1310 Barnes町， DolleryCT,MacDermotJ.Increasedpulmonaryalpha....adre吧en肘電er咆gicandreducedb阮eta--adren肘e憂er咆宮gicre飛噎咒ceepteorsine缸xp嚴erimentalasthma.Nature,1980, 285（5766）:569實驗材料〈包括動物品種、規(guī)格、數(shù)量和來源:藥品名稱、規(guī)格和來源、主要儀器設(shè)備等〉藥物 艾葉泊（杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司,采用真空精溜法提取,批號:950120），使用時用2%的吐溫-80（tween-80）乳化，再用蒸館水稀釋至不同濃度，分別為100gIL,20gIL,10gIL，IgIL，.并調(diào)節(jié)至pH=7o2.試劑 地塞米松（Dex，濟南永寧制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號050927）用時配成20g/L的溶液:磷酸組織膠（中國科學院上海生物化學研究所，批號。40513）用時配成Ig/L的溶液:氯化乙酷膽堿（Ach上海試劑二廠，批號。41119）使用時配成O.Ig/L的溶液:卵蛋白（Ovalbumin,Oval,上海東風生化技術(shù)有限公司，批號054306）;自制克氏液（K-H）:NaCl7.5g,KC1°?35g,NaH2P040.1g,NaHC031.0g,MgC12°?05g,CaC12O.24g,葡萄糖1g,CaClo另溶，加蒸館水至1000時，現(xiàn)用現(xiàn)配。3?儀器肌肉張力換能器，JZI00型，高碑店新航機電設(shè)備有限公司:超級恒溫器，CSW-501型，重慶試驗設(shè)備廠;BL-410微機型生物機能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技;Sigma銳at統(tǒng)計軟件（SigmaStat1.01forWindows飩，1992,Jandelcorporation,USA）;醫(yī)用氧氣，純度〉95%,廣州氣體廠。浴管，50pL和200pL的微量加樣器，L型鉤，線鉤，棉線若干，懾子，剪刀等。4.動物 Hartley品系豚鼠，雌雄兼有，體重350---450g,18只:體重200-250g,10只，山東大學實驗動物中心提供。實驗方法〈詳細寫明實驗步驟，尤其動物分組、給藥途徑和劑量、觀察指標、統(tǒng)計學處理方法及注意事項等〉（一〉實驗步驟一.艾葉泊對正常離體氣管及組膠和膽堿致氣管疫李的作用1,取350g-450g豚鼠18只，雌雄不拘，按照重量從小到大編號18。

啟動水浴 啟動超級恒溫水浴，調(diào)節(jié)浴溫至37°C3.調(diào)節(jié)記錄系統(tǒng)啟動微機，進入BL-410系統(tǒng)，將張力換能器與通道1相連，在"輸入信號"菜單中選擇"通道一"下"張力"菜單項，增益選擇100，掃描速度選擇25.0s/div。在張力換能器上清掛2g重物，記錄線上升2大格左右，取下重物，記錄線回原位。標本制備取一只豚鼠，將豚鼠擊頭致死后迅速取出喉與隆突之間氣管，浸入通5%CO2和95%O2混合氣的Krebs—Henseleit（K—H）液中，輕柔去除氣管周圍疏松結(jié)締組織和脂肪后，剪成寬約3mm,長20mm的氣管螺旋條，每只豚鼠制備3個。懸掛標本用L型鉤和線鉤對角位置鉤住氣管螺旋條，放人含20mlK-H液的37°C恒溫浴管中，固定L型鉤使氣管條處于液面下適當位置，持續(xù)通以含5%C02和95%02的混合氣（1-個氣泡Is）。線鉤通過絲線掛于張力換能器上，調(diào)節(jié)浴管和張力換能器的位置，使絲線位于浴管中央位置。調(diào)節(jié)鐵支架上的螺旋從而調(diào)節(jié)L型鉤的高低，使記錄線上升2大格左右，即掛2g重物時曲線的位置（此時標本的靜息張力即為2g）。每20mii換1次營養(yǎng)液，平衡60mi后開始實驗。（二〉實驗項目艾葉泊對正常離體氣管的影響取一個豚鼠的3個標本實驗待標本穩(wěn)定后，用累積劑量法依次加入20卩濃度為19/L勺艾葉泊、18卩濃度為10g/L的艾葉油、90yL濃度為20g/L的艾葉泊、180卩濃度為100g/的艾葉泊。以2%吐溫-8C為空白對照組，加同等劑量的2%吐溫-80容液。以地塞米松（加入200卩濃度為20g/的地塞米松溶液〉為陽性對照組［8］。每次加藥后要等5min寺反應穩(wěn)定。根據(jù)所測量的張力計算平均張力及抑制率。結(jié)果見表2-1。完成后用其他5只豚鼠重復實驗。將結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得出統(tǒng)計學結(jié)果。（用微機和SigmaStat計軟件（SigmaStat1.01forWindows1952Jandelcorporat侃，USA）,統(tǒng)計學處理計量資料均以x+-s表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學處理。P<O.0時5兩組間差異有顯著性。）統(tǒng)計學結(jié)果見表2-2。加藥后張力一加藥前張力變化率=加藥前張力X變化率=加藥前張力X100%表2-1艾葉泊對正常離體氣管的影響組別 管內(nèi)終末濃度（mgjL）藥前張力 給藥后張力 變化率2%吐溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200表2-2艾葉泊對正常離體氣管的影響（x七，n=6)組別管內(nèi)終末濃度（mg/_）變化率2%葉溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200注:統(tǒng)計方法:Dunnett's，與吐溫組比較，p ;與地塞米松組比較P艾葉泊對HIS致離體氣管痊孿的影響待標本穩(wěn)定后，在浴管中，加入60pL濃度為Ig/L的HIS溶液（浴管內(nèi)藥物終濃度2.5X10泣/L[9]）致痊后，，用累積劑量法依次加入20pL濃度為Ig/L的艾葉泊、18pL濃度為10g/L的艾噸泊、90pL濃度為20g/L的艾葉泊、180pL濃度為100g/L的艾葉泊。以2%吐溫-80為空白對照組，加同等劑量的2%吐溫-80溶液。以地塞米松（加入20011L濃度為20g/L的地塞米松溶液〉為陽性對照組臉嘰每次加藥后要等5min待反應穩(wěn)定，根據(jù)所測量的張力計算平均張力及抑制率。結(jié)果見表3-10完成后用其他5只豚鼠重復實驗。將結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得出統(tǒng)計學結(jié)果?！从梦C和SigmaStat統(tǒng)計軟件（Sigma臼at1.01forWindows95， 1992,Jrnde1corporati侃，USA），統(tǒng)計學處理計量資料均以x七表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學處理。PvO.05時兩組間差異有顯著性?！到y(tǒng)計學結(jié)果見表3-2。加藥后張力一加藥前張力 X100%變化率= 加藥前張力表3-1艾葉泊對HIS致離體氣管痊孿的影響組別管內(nèi)終末濃度 加入HIS后給藥后張力張力2%葉溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200表3-2艾葉泊對HIS致離體氣管痊孿的影響(x土s,n6)組別管內(nèi)終末濃度(mg/_)張力抑制率2%葉溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200注:統(tǒng)計方法:Dunnett，s,與吐溫組比較，，P:與地塞米松組比較，P艾葉泊對Ach所致離體氣管痊孿的影響待標本穩(wěn)定后在浴管中加入166yL濃度為0.1g/L的Ach溶液(浴管內(nèi)藥物終濃度8.3X10壟/L[9])致痊后，用累積劑量法依次加入20yL濃度為19/L的艾葉油、18yL濃度為10g/L的艾葉泊、90yL濃度為20g/L的艾葉油、180yL濃度為100g/L的艾葉泊。以2%吐溫-80為空白對照組，加同等劑量的2%吐溫-80溶液。以地塞米松(加入2001L濃度為20g/L的地塞米松溶液〉為陽性對照組[8]根據(jù)所測量的張力計算平均張力及抑制率。結(jié)果見表4-1。完成后用其他5只豚鼠重復實驗。將結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得出統(tǒng)計學結(jié)果?！从梦C和SigmaStat統(tǒng)計軟件(SigmaStat1.01forWindows飩，1992,Jandelcorporation，USA)，統(tǒng)計學處理計量資料均以x+s表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學處理°P<0.05寸兩組間差異有顯著性。)統(tǒng)計學結(jié)果見表4-2

表4-1艾葉泊對Ach所致離體氣管痊孿的影響組別管內(nèi)終末濃加入Ach后給藥后張力張力2%葉溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200表4-2艾葉油對Ach所致離體氣管痊孿的影響（x土s,n=6）組別管內(nèi)終末濃加入Ach后給藥后張力張力2%葉溫-80組10艾葉油1101001000地塞米松200張力抑制率=張力抑制率=給藥后張力一加入Ach后張力加入Ach后張力注:統(tǒng)計方法：Dunnet，s,與吐溫組比較，p；與地塞米松組比較，p二.艾葉油對抗原所致離體氣管痊孿的影響建立模型 哮喘豚鼠離體氣管平滑肌環(huán)的制備健康豚鼠10只，雌雄不拘，200250g采用10g/卵蛋白生理鹽水1m腹腔注射以建立哮喘模型[10]時制備標本 14c后擊頭致死，迅速取出主氣管，剪除周圍結(jié)締組織，剪成寬約3mm長20m的氣管螺旋條，每只豚鼠制備6個啟動系統(tǒng)，懸掛標本同上加藥取一只豚鼠的6個氣管螺旋條進行實驗。待標本穩(wěn)定后，艾葉泊實驗組分別加入20卩濃度為Ig/的艾葉泊、20卩濃度為10g/的艾葉泊、100卩濃度為20g/的艾葉泊、200卩濃度為100g/的艾葉泊。以2%土溫-8（為空白對照組，加同等劑量的2%土溫-80溶液。以地塞米松〈加入200卩濃度為20g/的地塞米松溶液〉為陽性對照組[8]010min后各組均加卵白蛋白。-地，每次加藥后要等5mi待反應穩(wěn)定。結(jié)果見表5-1完成后用其他9只豚鼠重復實驗。將結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得出統(tǒng)計學結(jié)果?！从梦C和SigmaSta統(tǒng)計軟件(SigmaStat1.01forWindowsL992JandelcorporaticUSA)統(tǒng)計學處理計量資料均以x土s表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學處理。P<O.0時兩組間差異有顯著性?！到y(tǒng)計學結(jié)果見表5-2。給藥后張力一加入卵蛋白后張力 xlOO%收縮抵制率=1一 給藥后張力一加入卵蛋白后張力(吐溫組〉表5-1艾葉泊對抗原所致離體氣管痊孿的影響組別 管內(nèi)終未濃度(mg/L)給藥后張力 加卵蛋白后張力 收縮抵制率2%葉溫-80組10 ——艾葉油1101001000地塞米松 200表5-2艾葉油對抗原所致離體氣管痊孿的影響(x