無機(jī)抗菌劑的抗菌性能檢測方法

無機(jī)抗菌劑的抗菌性能檢測方法

有機(jī)抗菌劑是一種利用有機(jī)重金屬離子抗菌作用的新型抗菌材料。與有機(jī)抗菌劑相比，它具有光譜、耐鹽性和安全性。隨著人們對環(huán)境質(zhì)量要求的提高,無機(jī)抗菌劑具有廣闊的市場前景。但目前對該類抗菌劑抗菌性能的檢驗(yàn)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),對抗菌加工品的抗菌性能測定僅見于行業(yè)參考,并且不同抗菌劑抗菌性能間的比較缺乏規(guī)范標(biāo)準(zhǔn),有較大的隨機(jī)性。本文探討了無機(jī)抗菌劑對細(xì)菌的作用,綜述了國內(nèi)外常用的測定方法,旨在為無機(jī)抗菌劑及其加工品的性能評價(jià)提供合適的檢測手段。1靜菌作用的測定無機(jī)抗菌劑對細(xì)菌的作用表現(xiàn)在兩個方面:抑菌與殺菌。抑菌指在細(xì)菌的增殖期,無機(jī)抗菌劑吸附于細(xì)胞壁上,與細(xì)胞膜蛋白(如S-S鍵)結(jié)合,破壞膜中的酶,防止細(xì)胞生長所需能量代謝的電子傳遞,抑制細(xì)菌個體生長的作用,又稱為靜菌作用。殺菌是指當(dāng)細(xì)菌處于非增殖期時(shí),無機(jī)抗菌劑對細(xì)胞膜酶的破壞,導(dǎo)致細(xì)菌維持個體生存所需的能量代謝不能正常進(jìn)行而死亡的作用。1.1抗菌藥劑的誘導(dǎo)效果若細(xì)菌在生長初期的菌數(shù)為N0,經(jīng)t時(shí)間細(xì)胞分裂,其菌數(shù)N與時(shí)間關(guān)系如下:In(N/N0)=μt(1)式中μ稱為該菌繁殖的比增殖速度。若有抗菌藥劑存在,由于靜菌作用,細(xì)菌的比增殖速度降為μi,可用增殖阻害度H來表示抗菌劑的靜菌力大小:H=(μ-μi)/μ(2)H與藥劑濃度C的關(guān)系,可用一經(jīng)驗(yàn)式來表達(dá):H=Cn/(In5050n+Cn)(3)式中I50是當(dāng)細(xì)菌50%受阻時(shí)藥劑濃度。將(2)式代入(3)式得:μ/μi=1+(C/I50)n(4)另外,在誘導(dǎo)期,添加抗菌藥劑后細(xì)菌生長的誘導(dǎo)時(shí)間τi較無添加時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)間τ更長。同樣用H來表示阻害度:H=(τi-τ)/τ(5)可得τi/τ=1+(C/I50)n(6)由上可知,抗菌劑的靜菌力是與Cn成比例的,抗菌劑濃度的增加,將導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)育強(qiáng)烈受阻。1.2濃度對抗菌活性的影響若穩(wěn)定期的細(xì)菌菌數(shù)為N0,加入抗菌劑后菌數(shù)減少到N,可用式(7)來表示兩者間的關(guān)系:In(N/N0)=-Kdt(7)Kd稱為殺滅速度常數(shù),它與抗菌劑濃度有關(guān):Kd=KCn(8)K隨菌種、抗菌劑不同而不同。由上可知,抗菌劑的K越大,其殺菌作用越強(qiáng);同一抗菌劑的殺菌力隨濃度增大而急劇上升。日本的檜山圭一郎研究了不同濃度的醋酸銀對金黃色葡萄球菌生長的影響,得到的增殖曲線表明:低濃度的藥劑使細(xì)菌誘導(dǎo)期變長,但對比增殖速度的影響并不明顯;當(dāng)藥劑濃度增大到一定值時(shí),菌數(shù)下降,說明高濃度的藥劑對細(xì)菌直接起殺滅作用。他還考察了穩(wěn)定期抗菌劑對菌體的影響,得到的死滅曲線是直線,可知抗菌劑對細(xì)菌的殺滅是完全的一次反應(yīng)。2殺菌力與靜菌力如前所述,抗菌劑抗菌性能包括抑菌作用(即靜菌力)與殺菌作用(即殺菌力)。對于抗菌劑本身抗菌性能的檢測,包括靜菌力評價(jià)與殺菌力評價(jià)兩方面的內(nèi)容。2.1靜菌力評價(jià)靜菌力一般采用電導(dǎo)率法或MIC法來評價(jià)。2.1.1有好的微生物生長微生物在生長過程中,消耗營養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)而放出有機(jī)酸和氨基酸兩種電解質(zhì)。微生物生長越快,電解質(zhì)濃度就越大,營養(yǎng)液的導(dǎo)電性也越好,電導(dǎo)率也就越大。以不含抗菌劑的菌營養(yǎng)液作參比,以加有抗菌劑的菌營養(yǎng)液為處理液,比較兩種條件下電導(dǎo)率的變化趨勢,就可推斷抗菌劑的靜菌力。2.1.2抗菌劑mic值的測定MIC是指使微生物發(fā)育受阻所需的最小抗菌劑濃度。MIC值越小,抗菌劑的靜菌活性越大。MIC的測定有兩種方法,其一是液體稀釋法。以不含無機(jī)抗菌劑的菌液作參比,以營養(yǎng)液作稀釋液,把抗菌劑液稀釋不同倍數(shù)后,加入一定濃度的菌液,混合后作處理液。測定參比液與處理液各自的濁度,若抗菌劑濃度為Cx的處理液濁度與參比液濁度相等,則此Cx即為MIC值。其二是固體稀釋法(即培養(yǎng)基法)。在培養(yǎng)基中加入不同量的抗菌劑,混凝成平板,培養(yǎng)菌種,1周后觀察菌種生長情況,不生長菌的平板所含抗菌劑濃度即為該抗菌劑的MIC值。后法操作較簡單,但影響因素多,結(jié)果較粗。2.2消毒能力的評價(jià)殺菌力可通過測定細(xì)菌數(shù)量、濁度、MBC等值來評價(jià),相應(yīng)的方法分別稱為細(xì)胞數(shù)量測定法,比濁法和MBC法。2.2.1菌落計(jì)數(shù)法colitact通過測定比較參比樣與抗菌劑處理樣細(xì)菌數(shù)量的增減來評價(jià)抗菌性能。細(xì)胞數(shù)量的測定,多采用菌落計(jì)數(shù)法(colonycount)。對于微生物,在理論上可認(rèn)為高度稀釋時(shí)每個活的單細(xì)胞均能繁殖成一個菌落(colony),因而可以用培養(yǎng)的方法使每個活細(xì)胞生長成一個單獨(dú)的菌落,并通過長出的菌落數(shù)去推算菌懸浮液中的活菌數(shù),由此而來的方法即為菌落計(jì)數(shù)法。以菌液作為參比液,在菌液中加入抗菌劑后,采用平板涂抹法,在37℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后測定參比液與處理液的生存菌數(shù),計(jì)算增減值差:增減值差=-1g(處理液生存菌數(shù)/參比液生存菌數(shù))若該值大于2,則認(rèn)為該抗菌劑具有殺菌作用。2.2.2生理功能類的研究該法依然根據(jù)菌落計(jì)數(shù)測定原理,但適合于測定在一個微生物群中不占優(yōu)勢卻具有特殊生理功能的類群,例如污水、牛奶及其它食品,或其它場合下的特殊微生物。在測定之前,先采用液體稀釋培養(yǎng)法,利用待測菌特殊生理功能的選擇性來擺脫其它微生物的干擾,逐代優(yōu)化待測菌,并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該群微生物的存在豐度,以示殺菌力。2.2.3比濁法在一定濃度范圍內(nèi),菌懸浮液中的微生物細(xì)胞濃度與濁度成正比,因而通過測定濁度,間接比較菌液與處理液菌量,可檢測抗菌劑殺菌性能。2.2.4不同濃度抗菌劑懸浮液的制備MBC為抗菌劑殺滅細(xì)菌所需最低濃度。該值越小,抗菌劑的殺菌力越大。以無菌水作稀釋液,把細(xì)菌配成個數(shù)濃度(以下簡稱為濃度)106個/ml的懸浮液,把抗菌劑懸浮液稀釋到不同倍數(shù)。取菌液1ml,不同濃度的抗菌劑懸浮液1ml,混合后于30℃水浴中振蕩1h,然后加入到2ml的新鮮培養(yǎng)液中,37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h,以不含細(xì)菌的抗菌劑懸浮液作參比,測參比液與處理液各自的濁度。若抗菌劑濃度為Cx的處理液濁度與參比液濁度相等,則此Cx即為MBC值。3抗菌加工品的殺菌力鑒定由抗菌加工品的靜菌力引起的細(xì)菌生存菌數(shù)X的變化,可用下式來表示:-dX/dt=μX-g(X)-f(X)-h(X)式中-dX/dt是細(xì)菌的總死滅速度,f(X)是由抗菌劑引起的細(xì)菌死滅速度,g(X)是由稀釋液引起的細(xì)菌死滅速度,h(X)是由于菌膜與試料間接觸引起的細(xì)菌死滅速度。欲判定抗菌加工品的靜菌力,可比較抗菌加工品與非加工品生存菌數(shù)變化,用菌數(shù)增減值差來作為評價(jià)指標(biāo)。由抗菌加工品殺菌力引起的細(xì)菌菌數(shù)變化,可用下式來表示:-dX/dt=kdX+g(X)式中KdX是抗菌劑的殺菌速度,g(X)是由稀釋液引起的細(xì)菌死滅速度。由于殺菌是一次反應(yīng),可用滅菌率作為指標(biāo)來評價(jià)殺菌力:滅菌率=(試驗(yàn)前菌數(shù)-試驗(yàn)后菌數(shù))/試驗(yàn)前菌數(shù)×100%若試驗(yàn)材料的滅菌率與參比材料的滅菌率之差大于26%,則認(rèn)為該試驗(yàn)材料有殺菌作用。殺菌力的評價(jià)指標(biāo),有直接計(jì)數(shù)、滅菌率或增減值差、抑菌圈三種,各指標(biāo)的測定因檢測時(shí)抗菌材料形態(tài)與檢測操作不同,手段也多樣。3.1直接計(jì)數(shù)指標(biāo)在顯微鏡下直接觀察菌面積,通過比較處理前后面積變化來評價(jià)抗菌性。此法多用于抗真菌試驗(yàn)。3.2消毒率或增減率的差異指標(biāo)3.2.1供試片與參比片的增注完善將抗菌加工品制成供試片,未加抗菌劑的加工品制成參比片,滴上菌液(磷酸緩中液,pH=7.0),使菌液在試驗(yàn)片上成膜,于菌膜上覆蓋PE薄膜,37℃恒溫條件下保存18~24h。之后用磷酸緩沖液將菌液淋洗下來,采用菌落計(jì)數(shù)法測生存菌數(shù)。計(jì)算供試片與參比片的增減值差,評價(jià)加工品的抗菌力。該法用于檢測表面光滑的塑料、橡膠、陶瓷、金屬成品的抗菌性能。3.2.2生存菌株生存測定該法用于具有吸水性的加工品性能檢測。菌液用1/500倍數(shù)的培養(yǎng)液稀釋成濃度為104個/ml的懸濁液,在試驗(yàn)片(50×50mm)上滴1滴或數(shù)滴該懸濁液,使菌液以液滴形式存在。在37℃下恒溫保存18~20h,測生存菌數(shù)。計(jì)算增減值差。3.2.3菌種生存測定把材料切成18mm長的試驗(yàn)片,稱取0.4g放入300ml廣口瓶中。在高壓釜中121℃條件下滅菌15min。菌液經(jīng)培養(yǎng)后,以1/20倍數(shù)的培養(yǎng)液稀釋,調(diào)成濃度為105個/ml的懸濁液。在試驗(yàn)片上滴菌懸濁液0.2ml,使菌液以菌滴形式存在。恒溫35~37℃培養(yǎng)18h后,測定生存菌數(shù),比較滅菌率。該法主要用于疏水制品的檢測。3.2.4菌落率測定對于非溶出型抗菌材料,將它和菌液在25℃下于錐型瓶中強(qiáng)烈振蕩1h,以增加菌與測試物的接觸。測定生存菌數(shù),計(jì)算滅菌率。此法多用于紡織品、纖維等表面粗糙的制品檢驗(yàn)。由于強(qiáng)烈振蕩,菌液易起泡沫,對抗菌性能評價(jià)有一定影響。3.2.5抗菌加工品抗菌性能的測定將材料加工成50×50×3mm的試驗(yàn)片,置于聚乙烯容器中,滴上濃度為103~106個/ml的菌液(磷酸緩沖液,pH=7.0),使材料周圍形成1mm厚的菌層,之后把容器口用60mm寬的透明PP帶封住,用40W燈光照射,25℃條件下振蕩1h,之后采用平板法測菌數(shù),比較抗菌加工品與未加抗菌劑的加工品的滅菌率。該法適用于表面粗糙的纖維制品、樹脂成品以及非溶出型(如磷酸鋯載帶銀離子抗菌劑)材料。3.2.6增菌劑對抗菌性能的影響該法是檢測半導(dǎo)體光催化加工制品抗菌性能的唯一方法。將試樣加工成尺寸為40×40mm的薄片,把30×30×0.12mm的蓋玻片置于薄片中央,于紫外光下照射一定時(shí)間后測定菌數(shù),計(jì)算增減值差。3.3抗菌制品的檢測方法菌用滅菌生理鹽水調(diào)至濃度為108個/ml,與營養(yǎng)液混合,固化成試驗(yàn)平板,把材料加工成圓盤,置于平板中央,在此圓盤上會出現(xiàn)菌生長禁止圈(即抑菌圈)。37℃下培養(yǎng)18h后,比較抗菌材料與參比材料抑菌圈的面積,評價(jià)抗菌材料的性能。該法較適合于纖維制品?，F(xiàn)將抗菌制品對應(yīng)的檢測方法法歸納如表1?？咕庸て返目咕阅軝z測,應(yīng)根據(jù)材料的親水性、抗菌劑的溶出性以及抗菌材料的外在形態(tài)等,選擇和使用相應(yīng)的測試方法。4抗菌性能的測定抗菌加工品的抗菌效力,除了可用上述指標(biāo)來評價(jià)外,還可以量化的Da值作為判定基準(zhǔn)。Da值為在某一條件下細(xì)菌數(shù)減少到起始菌數(shù)10%所需要的時(shí)間。若起始菌數(shù)為N0,在最佳生長條件下,細(xì)菌繁殖到2N0所需要的時(shí)間T,可根據(jù)生長公式(1)In(N/N0)=μt來計(jì)算:T=In2/μmax因?yàn)榧?xì)菌處于最佳生長條件,所以式中取細(xì)菌的最大比增殖速度μmax。當(dāng)有抗菌劑存在時(shí),細(xì)菌菌數(shù)減少到1/2N的時(shí)間稱為半衰期D50,因?yàn)榭咕鷦?xì)菌的殺滅是完全的一次反應(yīng),所以D50與Da滿足以下關(guān)系式:D50=0.301Da對某一細(xì)菌而言,只有當(dāng)抗菌劑存在時(shí)的半衰期D50小于T時(shí),才會因抗菌劑的抗菌作用而引起發(fā)育受阻、個體死亡,即:D50<T整理后得:0.301Da<In2/μmax=0.693/μmax即:Da<2.303/μmax細(xì)菌由于抗菌劑的抗菌作用而引起的菌數(shù)減少所需要的最大D50、最大Da與細(xì)菌的μmax關(guān)系可表示為:(D50)max=0.693/μmax(Da)max=2.303/μmax向細(xì)菌液中加入某一抗菌劑,只有該條件下的D50<(D50)max、Da<(Da)max時(shí),此抗菌劑才有抗菌效力。不同細(xì)菌的最大比增殖速度不同,其所對應(yīng)的由抗菌劑引起的最大半衰期、最大Da值也不同,如表2所示。通過測定某一抗菌劑存在時(shí)的半衰期