消化內(nèi)鏡活檢管路生物膜去除方法的探討

消化內(nèi)鏡活檢管路生物膜去除方法的探討

現(xiàn)在，胃鏡是診斷和治療胃腸道疾病的重要手段。美國每年有2000萬人進(jìn)行胃腸內(nèi)科手術(shù)。合理嚴(yán)格的內(nèi)鏡清洗消毒是內(nèi)鏡手術(shù)能夠安全開展的根本前提。生物膜目前被認(rèn)為是引起內(nèi)鏡感染的一個(gè)重要因素,內(nèi)鏡清洗過程中有效去除生物膜是能夠有效避免內(nèi)鏡相關(guān)感染的重要措施。本研究通過抽取臨床使用的內(nèi)鏡活檢管路樣本,檢測(cè)里面生物膜生長(zhǎng)情況,并通過不同方法去評(píng)價(jià)臨床使用的清洗劑對(duì)內(nèi)鏡管路中生物膜的清除效果,為內(nèi)鏡生物膜相關(guān)問題的研究方法和解決方法提供指導(dǎo)和參考。1zity公司的檢血藥檢血檢查試劑:LB肉湯培養(yǎng)基及瓊脂(Promage生物制劑公司),0.1MPBS,1%鋨酸,乙醇,100%丙酮,100%醋酸異戊酯,0.3%結(jié)晶紫,20mmol/LMES,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Promage),多酶清洗劑(RMEC,Rapidmulti-en-zymecleaner,3M),無酶清洗劑(Intercept,Mediva-tors),無菌蒸餾水。器材:CO2臨界點(diǎn)干燥儀、離子濺射儀、stereoscan260型掃描電鏡、循環(huán)式灌流器、超聲波振動(dòng)器(Olympusultrasoniccleaner,Olym-pus)、酶標(biāo)儀(Bio-Red,美國)。臨床胃鏡活檢管路組(共計(jì)10根),只做掃描電鏡檢查,從內(nèi)鏡活檢管路先端每距離15cm截取1.5cm的片段去做掃描電鏡檢查。對(duì)照組:內(nèi)鏡活檢管路生物膜模擬物2cm×18段,處理方式為僅用0.1MPBS,浸泡10min。Intercept組:內(nèi)鏡活檢管路生物膜模擬物2cm×18段,處理方式為無酶清洗劑Intercept按照1∶300比例配置后,浸泡10min。RMEC組:內(nèi)鏡活檢管路生物膜模擬物2cm×18段,處理方式為RMEC(Rapidmulti-enzymecleaner)按照1∶400比例配置后,浸泡10min。1.3tsb-bca法取少量斜面保種的大腸埃希菌菌株,接種于無菌Muller-Hinton肉湯培養(yǎng)基獲得純種菌液。用傾注平板法,調(diào)整細(xì)菌濃度為106CFU/ml備用。取配制好的菌懸液2ml,加入到含200mlTSB的三角燒瓶中,使其菌液濃度為102CFU/ml備用。用帶有通氣孔(過濾層0.22mm)的塞子將燒瓶塞住,通過通氣孔延伸到瓶底,另一個(gè)軟管在TSB液面上。通過蠕動(dòng)泵和軟管子將內(nèi)鏡管路連接組成管道系統(tǒng),保持在370C的條件,用蠕動(dòng)泵在10ml/min的流量下循環(huán),4h/d。每日更換TSB,連續(xù)培養(yǎng)5d。第6天用500ml無菌生理鹽水以10ml/min的流速?zèng)_洗管腔去除管腔內(nèi)壁的浮游菌。培養(yǎng)完后的內(nèi)鏡管路取下,每15cm長(zhǎng)度截取1.5cm的樣品備用。轉(zhuǎn)移至無菌EP管的內(nèi)鏡管路材料以1%鋨酸固定1h,0.1mol/LPBS沖洗兩次,每次15min,系列乙醇脫水,100%丙酮脫水15min,醋酸正戊酯置換,CO2臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金,然后用掃描電鏡觀察、拍照。將材料置于含1ml0.1mol/LPBS的無菌EP管中超聲振蕩(38~47kHz,10min)使生物膜從管壁材料上剝離,吸取其中100μlPBS,以一定比例稀釋后分別以0.1ml量加入無菌平皿中,并倒入冷卻至50℃的M-H瓊脂20ml,混勻,冷卻后置37℃孵育24h,觀察菌落生長(zhǎng)情況,作菌落計(jì)數(shù)。將材料分別加入5ml滅菌PBS,浸沒于40KHz(20℃)超聲波清洗器中超聲清洗6.5min后,漩渦震蕩2min。取待測(cè)樣品100μl分別同2mlBCA反應(yīng)液混合,60度加熱30min,冷卻后測(cè)量562nm吸光值。各組管路片取出以后,用PBS沖洗,分別放置到50ml的離心管中,分別加入25ml,0.3%的結(jié)晶紫溶液浸泡90min后,取出用PBS沖洗3次,風(fēng)干。然后將樣本分別放入離心管中,并加入1ml,95%乙醇后再50KHz超聲5min后,取200μl按照1∶50體積比和95%乙醇混合后測(cè)量540nm下吸光值。生物膜清除率%=(1-試驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。數(shù)據(jù)錄入和管理通過Excel軟件,使用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2生物膜的生長(zhǎng)情況總共送檢了10根胃鏡活檢管路,掃描電鏡結(jié)果顯示,有4根活檢管路中生物膜生長(zhǎng)情況復(fù)雜,見圖1A;看到明顯的細(xì)菌結(jié)構(gòu)形狀,見圖1B;胃鏡活檢管路完全干凈的表面,見圖1D;模擬胃鏡活檢管路生物膜生長(zhǎng)的材料表面生物膜生長(zhǎng)非常明顯,見圖1C。2.2各組生物膜清除率的比較不同清洗劑處理后的模擬污染物通過細(xì)菌計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)定量法和結(jié)晶紫定量法檢測(cè)后,見表1,無酶清洗劑組通過細(xì)菌計(jì)數(shù)法、蛋白質(zhì)定量法、結(jié)晶紫定量法檢測(cè)對(duì)生物膜清除率分別為99.9%、94.3%和90.7%,而多酶清洗劑組分別為55.2%、40.7%和43.5%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3內(nèi)鏡生物膜的清除生物膜是導(dǎo)致臨床感染的重要因素,生物膜對(duì)于內(nèi)鏡的危害目前也漸漸得到大家的重視。目前導(dǎo)致內(nèi)鏡清洗消毒失敗的原因是內(nèi)鏡管路內(nèi)腔生物膜的形成,Hadi等發(fā)現(xiàn)即便很好的按照感染控制原則清洗消毒內(nèi)鏡,仍然有2%內(nèi)鏡手術(shù)導(dǎo)致患者細(xì)菌感染,最終原因就是內(nèi)鏡管腔內(nèi)壁形成生物膜。在前期掃描電鏡試驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)臨床上使用中的內(nèi)鏡內(nèi)管壁生物膜生長(zhǎng)的現(xiàn)象十分普遍,可見內(nèi)鏡管路中生物膜容易發(fā)生存在,必須有效清除。生物膜目前清除主要方式就是外力清洗或借助清洗劑清除,而內(nèi)鏡管腔結(jié)構(gòu)復(fù)雜、管腔直徑較小,就算借助清洗工具也不能完全保證管腔內(nèi)所有表面都有效洗刷,如果不能完全一次性清除可能容易再次生長(zhǎng)。清洗的同時(shí)就必須考慮接觸能夠去除生物膜的清洗劑來協(xié)同完成清洗工作,所以目前國外和國內(nèi)的內(nèi)鏡清洗消毒也推薦使用去生物膜清洗劑去防止生物膜滋生。早期相關(guān)研究通過在PVC管路中建立內(nèi)鏡生物膜模擬物來評(píng)價(jià)不同清洗劑或消毒方法對(duì)生物膜清除效果。而本研究是在實(shí)際臨床使用的內(nèi)鏡活檢管路材料上建立模擬生物膜污染物,并通過3種方法更嚴(yán)謹(jǐn)和客觀的評(píng)價(jià)不同清洗劑對(duì)生物膜的清洗效果,為臨床內(nèi)鏡清洗消毒中生物膜問題的解決方案提供更佳客觀科學(xué)的指導(dǎo)。1.1試劑和設(shè)備1.2小組1.3.1懸浮液的制備1.3.2細(xì)菌生物膜形成試驗(yàn)1.3.3掃描電子顯微鏡法對(duì)殘留生物膜的評(píng)價(jià)1.3.4細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)殘留生物膜的評(píng)價(jià)1.3.5用蛋白質(zhì)定量法評(píng)價(jià)殘留生物膜1.3.6采用結(jié)晶紫量化法評(píng)價(jià)殘留生物膜1.3.7數(shù)據(jù)計(jì)算1.4統(tǒng)計(jì)分析2.1掃描電子顯微鏡的結(jié)果2.2.1不同表面活性劑對(duì)生物膜模擬生長(zhǎng)物的影響