前荷葉堿單體的分離及鑒定

前荷葉堿單體的分離及鑒定

蓮子心是睡蓮科植物的成熟種子。它是中國(guó)北方和南方的一個(gè)省。其性味苦寒,具有清心安神、去熱,交通心腎、澀精止血之功效。曾有學(xué)者報(bào)道從蓮子心中提取得到了前荷葉堿,但都未對(duì)其進(jìn)行分離純化。在先前的研究中,我們通過超臨界CO2萃取技術(shù)從蓮子心中萃取脂溶性有效成分,發(fā)現(xiàn)除常見的揮發(fā)油成分外,還包含前荷葉堿。本文中我們將上述萃取物用柱層析分離技術(shù)分離純化,并用HPLC、TLC、GC-MS鑒別所得到化合物單體,得到純化的前荷葉堿,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料表面1.1儀器與檢測(cè)方法24LHA121-32-24型超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界實(shí)業(yè)公司);B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BHCHI公司);HP5988A型氣相色譜-質(zhì)譜連用儀(美國(guó)HP公司);LC-6A高效液相色譜儀(日本島津公司)。1.2樣品及標(biāo)準(zhǔn)品蓮子心購自廣州市藥材公司(江西產(chǎn));薄層層析用硅膠和柱層析用硅膠購自青島海洋化工廠;蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品、甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品、異蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室;乙腈、石油醚、三乙胺、乙酸乙酯等分析純購自廣州化學(xué)試劑廠。2方法2.1萃取條件的確定將粉碎成20目粗粉的蓮子心4.0kg投入萃取釜中,按重量比20%w/w加入乙醇為夾帶劑,按設(shè)定的萃取路線,進(jìn)行循環(huán)萃取,并保持恒溫恒壓,每隔一定時(shí)間從解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ放料。2.2層析主體層析柱的制備蓮子心超臨界萃取物200ml,加入200ml水,在磁力攪拌器下攪拌混勻,滴加冰醋酸調(diào)節(jié)至pH2.5,靜止萃取,收集下層(水層);用氨水調(diào)節(jié)該下層液體pH8.0,用無水乙醚萃取,收集上層,減壓回收醚層,得到揮干物。用10ml乙酸乙酯溶解后,加入20g100-200目的層析硅膠,充分混勻,裝載于50cm長(zhǎng)、含100g200-300目硅膠的層析柱上。洗脫液為乙酸乙酯∶石油醚∶三乙胺(5∶5∶1),按20ml每份收集,合并第19-42份收集管,減壓回收溶劑,約剩10ml時(shí),4℃存放3-4天,析出結(jié)晶后,過濾得到棕褐色產(chǎn)物,進(jìn)一步冷凍干燥,稱重,4℃避光保存。2.3乙腈水十二烷磺酸鈉dmpsC18ODS反相色譜柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為282nm,流動(dòng)相為乙腈∶水∶冰醋酸∶十二烷磺酸鈉(1100ml∶900ml∶20ml∶8.26g),流速為1ml/min。用甲醇50μg/ml濃度溶解純化前荷葉堿,進(jìn)樣10μl。2.4色譜鑒定原則2.4.1設(shè)立對(duì)照組為蓮子心甲醇回流提取物、蓮子心乙醇回流提取物;洗脫液為乙酸乙酯∶石油醚∶三乙胺(5∶5∶1),用碘化鉍鉀顯色鑒定生物堿;5μl點(diǎn)樣。2.4.2設(shè)立對(duì)照組為蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品,異蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品,甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品,蓮子心乙醇回流提取物;各取5μl點(diǎn)樣,碘化鉍鉀顯色鑒定。2.5乙醇溶解物載氣u選用Uitra12cm×0.2cm石英毛細(xì)管柱,柱溫為60～240℃,程序升溫8℃/min,柱前壓為20kPa,進(jìn)樣溫度為250℃,離子源EI為240℃,倍增變壓為2500伏,傳輸線溫度為240℃,進(jìn)樣量為乙醇溶解物5μl,載氣為氦氣。在該條件下對(duì)柱層析分離得到的樣品進(jìn)行GC-MS分析,所得各組分峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫自行檢索比較,并核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)圖譜,確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。3結(jié)果3.1得淺液混合物解析釜Ⅰ得深綠色液狀物,總體積為120ml;解析釜Ⅱ得淺黃色液狀物,總體積650ml。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇,分別得到膏狀物35g和65g,總得率為2.5%。3.2萃取物的制備4kg蓮子心經(jīng)CO2超臨界萃取后共得到770ml萃取物,取其中200ml行柱層析分離,共得到16mg棕褐色產(chǎn)物,經(jīng)計(jì)算總得率為0.0154‰。3.3前荷葉堿單體分離蓮子心甲醇回流提取物見少許前荷葉堿,蓮子心乙醇回流提取物未見前荷葉堿,柱層析分離純化后可見單一成分——前荷葉堿單體。與對(duì)照品比較,柱層析分離所得成分單一,純度高,且與蓮子堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿不一樣,為前荷葉堿。3.4峰a、b、c計(jì)算機(jī)圖譜的識(shí)別GC-MS圖中保留時(shí)間在16.25、18.01、23.44min處分別有三峰(A、B、C),經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫自行檢索比較,并核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)圖譜,證實(shí)A峰為十六酸,B峰為油酸,C峰為前荷葉堿。4前葉堿的分離純化蓮子心是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中重要藥物之一,含豐富的生物堿。自從富田真雄等分離出荷葉堿(Nuciferine)、蓮堿(Roemerine)、O-去甲荷葉堿(O-Nornuciferine)3個(gè)單體成分以來,迄今為止,從中分離出的生物堿類化合物已有20多個(gè),且均為異喹啉類生物堿,其中包括前荷葉堿,但未有研究對(duì)其進(jìn)行分離純化。前荷葉堿為原阿樸啡生物堿,而原阿樸啡生物堿可以存在2種還原狀態(tài),前荷葉堿主要為脂環(huán)酮型。日本學(xué)者曾報(bào)道從蓮子心中提取物得到了前荷葉堿外,王嘉陵等也曾報(bào)道用有機(jī)溶劑氯仿萃取,柱色譜純化分離得到前荷葉堿,其總得率為0.0148‰;我們先前采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從蓮子心中萃取脂溶性有效成分,用GC-MS方法進(jìn)行成分分析,得到了包括前荷葉堿在內(nèi)的14種主要化學(xué)成分。在此基礎(chǔ)上,用柱層析分離技術(shù)分離純化上述超臨界萃取物,得到了一種生物堿單體,并經(jīng)HPLC、TLC、GC-MS分析鑒定。HPLC分析結(jié)果可見A峰為溶劑,B峰為前荷葉堿,其后有一反折小峰C,為不同還原狀態(tài)的前荷葉堿。TLC分析對(duì)比見柱層析分離物單一,而GC-MS分析可見16.25、18.01min處分別有兩峰(A、B),經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫自行檢索比較,并核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)圖譜,為儀器中的殘流物或污染。上述數(shù)據(jù)與Baldwin等報(bào)道相符,證實(shí)其成分為前荷葉堿,為進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行功能研究奠定了基礎(chǔ)。本結(jié)果還表明利用SFE-CO2結(jié)合柱層析分離技術(shù)可很好的純化得到前荷葉堿單體,經(jīng)計(jì)算總得率為0.0154‰,與有