臭氧氣室對(duì)麥田土壤硝化作用的影響

臭氧氣室對(duì)麥田土壤硝化作用的影響

近幾十年來，隨著人類活動(dòng)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，周邊層的o3濃度顯著增加，污染范圍和破壞程度顯著增加，連續(xù)性不斷增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道,我國的京津唐地區(qū)、長江三角洲地區(qū)以及其他地區(qū)近地層O3濃度最高已達(dá)到150nmol·mol-1以上。O3作為溫室氣體和光化學(xué)煙霧的主要成分,已成為人們重點(diǎn)研究的主要環(huán)境污染物之一。生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)、能量的轉(zhuǎn)化和平衡對(duì)其生產(chǎn)力和穩(wěn)定性都至關(guān)重要,作為生物體結(jié)構(gòu)組成物質(zhì)并執(zhí)行所有生物化學(xué)過程的氮元素的循環(huán),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中起著十分重要的作用。包括氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化作用的硝化反應(yīng)在氮循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用,硝化反應(yīng)是由微生物驅(qū)動(dòng)的生物化學(xué)過程。氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)控制著硝化作用的第一步反應(yīng),即NH3氧化成NH2OH,是硝酸鹽形成的關(guān)鍵反應(yīng)之一。硝化細(xì)菌(NOB)在硝化作用過程中調(diào)控著NO2-轉(zhuǎn)化成NO3-的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因而土壤中上述3種微生物功能群的結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律受到人們的廣泛關(guān)注。小麥?zhǔn)俏覈镜募Z食作物之一,近地層O3濃度的增加已經(jīng)嚴(yán)重影響到麥地生態(tài)系統(tǒng),包括對(duì)地上部分過程以及地下生物反應(yīng)過程的影響。目前人們只注重于研究O3對(duì)生態(tài)系統(tǒng)地上部分的影響,而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)地下部分的影響研究較少。O3對(duì)生態(tài)系統(tǒng)地下部分的影響效應(yīng)比地上部分出現(xiàn)早,且其對(duì)地下生物過程影響有一個(gè)積累效應(yīng),但O3對(duì)麥地生態(tài)系統(tǒng)土壤氮素循環(huán)影響的機(jī)制較少有報(bào)道。本文通過大田試驗(yàn),結(jié)合開頂式氣室實(shí)驗(yàn)手段和RealtimePCR技術(shù)探討近地層O3濃度升高對(duì)冬小麥地土壤AOB、AOA和NOB數(shù)量的影響,為我國的大氣O3污染防治管理以及保障糧食安全提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1北京市苯氣候區(qū)概況實(shí)驗(yàn)地位于北京市昌平區(qū)種子管理站(40°12′N,116°8′E)。該站位于北京市西北部,屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候,全年四季分明,年均降水量為550.3mm,雨量集中在6—8月,雨熱同期,年均溫為11.8℃,年均日照時(shí)數(shù)2684h,無霜期為200d左右。1.2ssr-pcrstivuml.be工藝-生產(chǎn)經(jīng)營基地實(shí)驗(yàn)用作物為冬小麥,品種為北農(nóng)9549(TriticumaestivumL.Beinong9549),由北京農(nóng)學(xué)院提供。2009年9月28日播種,2010年4月26日追施尿素(225kg·hm-2)。整個(gè)生長期內(nèi)田間管理方式與當(dāng)?shù)乇３忠恢隆?.3氣室框架和o3濃度大田條件下建立開頂式氣室進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)。開頂式氣室模擬系統(tǒng)主要由框架和室壁構(gòu)成的氣室、通風(fēng)系統(tǒng)、過濾系統(tǒng)、O3發(fā)生系統(tǒng)、O3濃度控制系統(tǒng)、O3濃度自動(dòng)采集監(jiān)測系統(tǒng)等組成。開頂式氣室主體為正八面柱體,底邊長1.0m、總高2.7m,覆蓋面積約為4.8m2。氣室框架由鋼筋構(gòu)成,室壁材質(zhì)為聚乙烯塑料膜。系統(tǒng)內(nèi)O3通過醫(yī)用純氧(99.5%)經(jīng)O3發(fā)生器(SK-CFG-3,濟(jì)南)高壓放電作用產(chǎn)生。通過質(zhì)量流量計(jì)(GFC17,AalborgIndustries,Inc.,Carson,CA)和組態(tài)王工控軟件(MCGS6.2,北京)調(diào)節(jié)O2流量,進(jìn)而控制系統(tǒng)內(nèi)O3濃度。箱內(nèi)和自然大氣O3濃度通過2臺(tái)O3分析儀(Model49c,ThermoElectronCo.,Franklin,MA)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。O3濃度設(shè)4個(gè)處理:不熏O3(CK)、40、80、120nmol·mol-1O3。每個(gè)處理3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)從2010年4月5日開始熏氣,每日熏氣9h(8:00—17:00),6月12日停止熏氣,共熏氣50d。1.4土壤樣品的提取分別在2010年4月30日(拔節(jié)期)、6月22日(灌漿期)和12月13日(收獲期)采集土壤樣品。在每個(gè)氣室中用直徑2cm的土鉆分別采集0~10、10~20cm和20~40cm深度的新鮮土壤,每個(gè)土樣均由5個(gè)不同點(diǎn)的樣品混合而成,樣品裝入自封袋后帶回實(shí)驗(yàn)室用于測定土壤AOB、AOA和NOB的數(shù)量。所有土壤樣品均采用FastDNASPINKit(Bio101,Inc.,USA)試劑盒提取其總DNA,提取過程按說明書進(jìn)行;用ND-1000Spectrophotometer(Nanodrop)分析所提取DNA的OD260/OD280值,保證所提取DNA的質(zhì)量;用EppendorfPCR儀進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn),摸索各基因的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系;Real-timePCR反應(yīng)在型號(hào)為iQ5(Bio-rad,USA)的定量PCR儀上運(yùn)行,測定各基因的基因拷貝數(shù);所有擴(kuò)增反應(yīng)均采用SYBR(R)PremixExTaqTM(TaKaRa,Biotechnology)試劑盒進(jìn)行,反應(yīng)條件和引物濃度參見表1。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析土壤中AOB、AOA和NOB數(shù)量動(dòng)態(tài)可分別從其基因拷貝數(shù)變化反映出來,通過研究這3類細(xì)菌基因拷貝數(shù)變化來探討O3對(duì)土壤硝化作用的影響。用SPSS11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用O3濃度為因子,進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA,LSD,Duncan)。應(yīng)用Excel2003作圖。2結(jié)果與分析2.1不同土層的aod基因進(jìn)取液3和5.2.3的檢測在不同生長期和不同O3處理下,各土層的AOB基因拷貝數(shù)變化較大,最少僅為每克干土3.34×105個(gè)拷貝數(shù),最多可達(dá)每克干土2.91×106個(gè)拷貝數(shù)。冬小麥拔節(jié)期,0~10cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在低濃度O3處理下顯著比對(duì)照處理降低(P<0.05),40nmol·mol-1和80nmol·mol-1O3處理下AOB基因拷貝數(shù)分別比CK處理降低35.3%和46.8%,在120nmol·mol-1O3處理時(shí)AOB基因拷貝數(shù)與CK處理相比變化則不明顯(圖1);10~20cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在120nmol·mol-1O3處理下比CK處理顯著降低66.0%,而在低濃度O3處理下變化不顯著;20~40cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在40、80、120nmol·mol-1O3處理下均比對(duì)照處理顯著降低,分別降低39.8%、51.2%和59.4%。冬小麥灌漿期,0~10cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在3個(gè)O3處理下與CK處理相比均未發(fā)生顯著變化;10~20cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在80nmol·mol-1O3處理時(shí)較對(duì)照處理提高了102.7%。冬小麥?zhǔn)斋@期,0~10cm和10~20cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在不同O3處理下較對(duì)照處理均無顯著性變化,但是0~10cm和10~20cm土層的AOB基因拷貝數(shù)在O3濃度為80nmol·mol-1和120nmol·mol-1之間差異很顯著(圖2)。2.2對(duì)不同處理土壤aoa基因進(jìn)取液o3的影響在冬小麥的灌漿期和收獲期,不同的O3處理導(dǎo)致0~10cm和10~20cm土層的AOA拷貝數(shù)在每克干土5.13×106~2.01×107個(gè)范圍之間。冬小麥灌漿期,0~10cm土層的AOA基因拷貝數(shù)各個(gè)處理間差異均不顯著,說明O3處理沒有引起0~10cm土層的AOA基因拷貝數(shù)發(fā)生急劇變化。土壤深度為10~20cm時(shí),熏蒸40~120nmol·mol-1的O3與對(duì)照處理相比土壤的AOA基因拷貝數(shù)也沒有發(fā)生顯著變化,但是40nmol·mol-1O3處理的AOA基因拷貝數(shù)與120nmol·mol-1O3處理的AOA拷貝數(shù)之間差異達(dá)到顯著水平(圖3);冬小麥?zhǔn)斋@期,0~10cm和10~20cm土層的AOA基因拷貝數(shù)在各O3濃度處理下與對(duì)照處理相比均無顯著差異,但是80nmol·mol-1O3處理下0~10cm土層的AOA基因拷貝數(shù)與40nmol·mol-1和120nmol·mol-1O3處理的拷貝數(shù)存在顯著差異(圖3)。2.30cm土層的nob基因產(chǎn)業(yè)血工酶基因傳播特征在冬小麥的拔節(jié)期、灌漿期和收獲期,不同O3處理導(dǎo)致土壤NOB基因拷貝數(shù)變化也比較大,最少為每克干土2.99×107拷貝數(shù),最多達(dá)到了每克干土4.35×108拷貝數(shù)。冬小麥拔節(jié)期,0~10cm土層的NOB基因拷貝數(shù)在高濃度120nmol·mol-1O3處理下較對(duì)照處理有顯著降低,其降低比率達(dá)到39.7%(圖4);10~20cm土層的NOB基因拷貝數(shù)在濃度40nmol·mol-1和80nmol·mol-1O3處理下分別比對(duì)照提高了69.0%和117.8%;20~40cm土層中,各O3處理的基因拷貝數(shù)之間無顯著變化。冬小麥灌漿期,0~10cm和10~20cm土層的NOB基因拷貝數(shù)在80nmol·mol-1O3處理下較對(duì)照處理均有顯著提高,分別提高了242.8%和168.2%,其他處理與對(duì)照處理相比差異不顯著。冬小麥?zhǔn)斋@期,不管是0~10cm土層還是10~20cm土層,土壤的NOB基因拷貝數(shù)雖然隨O3濃度的變化有一些升高或降低的趨勢,但是經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均與對(duì)照處理差異不顯著(圖5)。3對(duì)土壤細(xì)菌活性的影響土壤氮循環(huán)是指N2、無機(jī)氮化合物、有機(jī)氮化合物在土壤中相互轉(zhuǎn)化過程的總稱,包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用等。土壤氮循環(huán)的每個(gè)轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)過程中均有微生物的參與,土壤微生物是土壤中各種生物化學(xué)和生理學(xué)過程動(dòng)態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)者。O3脅迫可影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物的活性。石春紅等研究發(fā)現(xiàn),O3濃度升高顯著地降低了土壤細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物的數(shù)量。較高的O3濃度(110nmol·mol-1)可造成根際土壤微生物多樣性指數(shù)、微生物量碳降低,但對(duì)非根際土微生物影響不大。本實(shí)驗(yàn)所采集的土壤樣品均來自根際土壤,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明O3脅迫影響了根際微生物的數(shù)量。冬小麥的拔節(jié)期、灌漿期和收獲期,不同濃度O3處理下AOB基因拷貝數(shù)在整體上有下降的趨勢,O3濃度越高AOB基因拷貝數(shù)下降越明顯,說明O3污染可抑制冬小麥拔節(jié)期土壤的氨氧化作用。但是O3處理非但不降低反而提高土壤的AOB基因拷貝數(shù),這可能是因?yàn)樵诖筇飳?shí)驗(yàn)條件下外界環(huán)境的多變性以及比較難于控制的特點(diǎn)導(dǎo)致不同O3處理下土壤氨氧化細(xì)菌活性不一致,從而引起土壤AOB基因拷貝數(shù)變化較大。0~10cm和10~20cm土層的AOB基因拷貝數(shù)總體上比20~40cm土層的AOB拷貝數(shù)多,因?yàn)?~10cm和10~20cm土層是植物根系生長的主要區(qū)域,土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷和鉀等養(yǎng)分含量較高,這有利于氨氧化細(xì)菌的繁殖和生長。Scagel和Andersen研究O3脅迫對(duì)北美黃松土壤微生物活性的影響,發(fā)現(xiàn)活真菌生物量和活真菌與細(xì)菌生物量比值均隨著O3脅迫時(shí)間的延長而增加。低O3(23μmol·mol-1)脅迫導(dǎo)致土壤真菌和細(xì)菌的生物量比對(duì)照處理增加,而高O3(31μmol·mol-1)脅迫導(dǎo)致土壤真菌和細(xì)菌的生物量降低。一些學(xué)者認(rèn)為,O3之所以可以抑制土壤微生物活性主要是通過改變植物葉片的組成和減少土壤落葉量,影響植物根系生長和改變土壤呼吸,降低植物根系有機(jī)和無機(jī)物的分泌。以往關(guān)于O3脅迫對(duì)小麥地下微生物群落的研究報(bào)道較少。對(duì)水稻地下微生物的研究表明,在O3脅迫下氨氧化細(xì)菌隨著水稻整個(gè)生長季節(jié)的變化也呈現(xiàn)出先增多后降低的趨勢。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相類似,說明O3脅迫雖然在冬小麥的一些生育期內(nèi)促進(jìn)土壤氨氧化細(xì)菌數(shù)量增加,但隨著O3濃度的增加其生理代謝活性趨于下降,從而擬制土壤的氨氧化作用。自然生境中AOA在數(shù)量、多樣性和棲居范圍等各方面都勝于AOB,因此與AOB處于不同生境的AOA可能是作為氨氧化過程的一種潛在種群。冬小麥灌漿期,0~10cm和10~20cm土層的AOA基因拷貝數(shù)變化不大,說明AOA對(duì)外界環(huán)境的耐性比較強(qiáng)。冬小麥灌漿期的AOA基因拷貝數(shù)比收獲期多,兩者比值為1.01~3.96,這與沈菊培等的報(bào)道基本相似。不同O3濃度處理下,0~10cm土層的NOB基因拷貝數(shù)多于10~20cm,這與丁玲玲等的研究結(jié)果比較一致。冬小麥灌漿期,0~10cm和10~20cm土層的N