外泌體未來的醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用新方向

Exosomes：Ourfuturetarget！

1精品課件簡介外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中細(xì)胞主動分泌的囊泡樣小體大小較為均一，直徑為40~100納米密度1.10~1.18

g/ml2精品課件3精品課件4精品課件5精品課件細(xì)胞外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程并有可能成為藥物的天然載體，應(yīng)用于臨床治療。ThéryC是建立外泌體提取別離鑒定金標(biāo)準(zhǔn)的泰斗(Théryetal,2006)。在Cell發(fā)表了一篇綜述，文中著重討論了EV對癌癥轉(zhuǎn)移作用的最新發(fā)現(xiàn)，下面就是她的綜述內(nèi)容6精品課件Exosomes還是EV?ThéryC提出應(yīng)該是"exosomes“而不是〞exosome〞(Théry,etal.2021)因為Exosome還含有另一個含義：外切酶體復(fù)合物，具有RNase活性。別離的產(chǎn)物假設(shè)沒有進(jìn)一步證明它的細(xì)胞內(nèi)來源，應(yīng)定義為混合的小EV——ExtracellularVesicles，即胞外囊泡。來自多泡內(nèi)體或MVB的才是exosomes，可檢測囊泡是否含內(nèi)體標(biāo)志蛋白證明，如CD63。

Multivesicularbodies，MVB=MVE

Multivesicularendosomes因此，這些exosomes的功能可能是廣義EV的，也可能是真正的exosomes。下面ThéryC的綜述中使用廣義的EV指沒有專門鑒定過大小的囊泡，使用小EV指小于200nm的小囊泡。7精品課件VEexosomes胞外其他囊泡（來自于其他個體或生物）8精品課件EV幫助癌細(xì)胞長出“腿〞？1.腫瘤來源的EV對受體細(xì)胞有不同的作用。在原發(fā)性腫瘤位點，EV能穩(wěn)定細(xì)胞突起，增強癌細(xì)胞運動能力。EV通過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)局部沉積，促進(jìn)定向的持續(xù)遷移，例如含有纖連蛋白(Fibronectin)的小EV。2.包含金屬蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接參與ECM重構(gòu)(Remodeling)，使特化的細(xì)胞突起具有降解能力，也就是侵入性偽足(Invadopodia)。ECM重構(gòu)幫助腫瘤細(xì)胞在組織之間遷移。9精品課件10精品課件3.EV可促進(jìn)腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的分化或募集，如纖維母細(xì)胞(Fibroblasts)和骨髓來源細(xì)胞(Bonemarrow-derivedcells,BMDC)。反過來，周圍纖維母細(xì)胞分泌的EV可以增強腫瘤細(xì)胞遷移能力及耐藥性。4.小EV還能進(jìn)入循環(huán)，從原發(fā)腫瘤到達(dá)遠(yuǎn)端位點。小EV的堆積可能增加血管通透性，EV可以進(jìn)入遠(yuǎn)端組織，誘導(dǎo)ECM重構(gòu)、募集BMDC以及后來的腫瘤細(xì)胞，制造轉(zhuǎn)移前微環(huán)境(Pre-metastaticniche)。11精品課件體內(nèi)分析EV轉(zhuǎn)移的方法將標(biāo)簽添加到分泌的EV里I.將熒光蛋白基因融合到棕櫚酰化(Palmitoylation)序列，標(biāo)記全細(xì)胞膜，通過mRNA的新熒光我們可以跟蹤結(jié)合或內(nèi)化了EV的細(xì)胞II.膜結(jié)合熒光素酶蛋白可以分析體內(nèi)發(fā)光細(xì)胞，這樣就能捕獲結(jié)合EV的熒光素酶蛋白或熒光素酶mRNAIII.用CRE重組酶，檢測EV內(nèi)的mRNA12精品課件13精品課件EV幫助小RNA轉(zhuǎn)運？miRNA分泌進(jìn)小EV，運輸進(jìn)靶細(xì)胞并發(fā)揮功能，直接調(diào)控miRNA靶標(biāo)。Pegteletal,2021，發(fā)現(xiàn)小EV轉(zhuǎn)運EB病毒miRNA到鄰近未感染的細(xì)胞，抑制靶基因。除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有可能是其他EV組分在靶細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源miRNA引起的。如何明確上述兩種情況？轉(zhuǎn)運的miRNA是外源基因組編碼的，如病毒的(Pegteletal,2021)或寄生蟲的(Bucketal,2021)，又或者受體細(xì)胞是小鼠的，并沒有所研究的miRNA(Alexanderetal,2021)。14精品課件EV與免疫最近報道發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中EV的RNA有著一段特殊的序列(Boelensetal,2021)：它帶有5'-triphosphate末端，通過RIG-I感應(yīng)器被受體細(xì)胞基質(zhì)識別，誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答，跟病毒感染類似。這種應(yīng)答也參與癌癥細(xì)胞對放療或化療的應(yīng)答。小EV與包膜病毒有相似作用？何種外表分子協(xié)助受體細(xì)胞膜融合RNA或小分子內(nèi)含物到細(xì)胞質(zhì)呢？這個問題有待探索。15精品課件外泌體別離和檢測16精品課件1.別離到目前為止，仍沒有一種提取方法能同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性。17精品課件1.1

離心法最常用的方法。收集細(xì)胞培養(yǎng)液以后依次在300

g、2

000

g、10

000

g離心去除細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100

000

g離心得到外泌體。得到外泌體量多，純度缺乏，電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。18精品課件1.2

過濾離心過濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心別離外泌體。截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質(zhì)量。外泌體是一個囊狀小體，相對分子質(zhì)量大于一般蛋白質(zhì)，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質(zhì)別離。這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度缺乏的問題。19精品課件1.3

密度梯度離心法分為連續(xù)和不連續(xù)梯度離心法。用于密度梯度離心法的介質(zhì)要求對細(xì)胞無毒，在高濃度時粘度不高且易將pH調(diào)至中性。實驗中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的根底上，預(yù)先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5

M

和0.25

M)配成連續(xù)梯度體系置于超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100

000

g離心16

h，外泌體會沉降到等密度區(qū)(1.10~1.18

g/ml)。用此種方法別離到的外泌體純度高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時，量少。20精品課件1.4

免疫磁珠法泌體相關(guān)抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水沖洗后，重懸于PBS緩沖液中。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備,

但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實驗。

21精品課件1.5

色譜法色譜法是利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進(jìn)行別離的分析的方法。樣品中大分子不能進(jìn)入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被流動相洗脫出來；小分子可進(jìn)入凝膠中絕大局部孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫出。別離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不廣泛。22精品課件2.

外泌體測量各種方法的比較23精品課件2.1

電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡(SEM)能夠直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。并且SEM具有很高的分辨率，能夠鑒別不同大小的外泌體。但SEM對樣品的預(yù)處理和制備上面要求較高，樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量。而且由于外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確的進(jìn)行外泌體濃度的測量。24精品課件2.2

動態(tài)光散射技術(shù)

動態(tài)光散射是收集溶液中做布朗運動的顆粒散射光強度起伏的變化，通過相關(guān)儀器將光強的波動轉(zhuǎn)化為相關(guān)曲線，從而得到光強波動的速度，計算出粒子的擴(kuò)散速度信息和粒子的粒徑。小顆粒樣品的布朗運動速度快，光強波動較快，相關(guān)曲線衰減較快，大顆粒反之。在外泌體研究中，動態(tài)光散射測量敏感度較高，測量下限為10納米。相對于SEM技術(shù)來說，樣品制備簡單，只需要簡單的過濾，測量速度較快。但由于動態(tài)光散射技術(shù)是測量光強的波動數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強波動信號會掩蓋較小顆粒的光強波動信號，所以動態(tài)光散射不適合大小不一的復(fù)雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無法測量樣品中外泌體的濃度。25精品課件26精品課件2.3

納米微粒追蹤分析術(shù)納米微粒追蹤分析術(shù)(以下簡稱NTA)是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實時的觀測納米顆粒。NTA通過光學(xué)顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度。

NTA系統(tǒng)的工作原理是將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進(jìn)行照射(光路圖見以下圖)27精品課件28精品課件激光光束從較小角度入射進(jìn)入樣品溶液，照亮溶液中的顆粒。配備相機(jī)的光學(xué)顯微鏡，被放置在特定的位置上，收集視野中被照亮的納米顆粒發(fā)射出的光散射信號。

樣品池有大約500微米的深度，采樣點激光照亮寬度為20微米，這個數(shù)值和光學(xué)顯微鏡的聚焦的視野深度相匹配。相時機(jī)進(jìn)行60秒的影像拍攝，每秒30個采樣畫面。顆粒的運動過程被NTA軟件進(jìn)行分析。NTA軟件在每幅被記錄的畫面中鑒別和追蹤做布朗運動的納米顆粒。29精品課件由于直接追蹤樣品中每一個納米顆粒，因此NTA技術(shù)對復(fù)雜的樣品具有極高的分辨率。為了證明NTA對于復(fù)雜樣品的分辨能力，我們將100納米和300納米兩種不同大小的聚苯乙烯顆粒按照5:1的數(shù)量混合，使用NTA進(jìn)行測量(圖3A)。盡管其分布圖形有一定的重疊，但兩種不同大小的納米顆粒的峰清楚的區(qū)分開來。這種對復(fù)雜樣品的分辨能力對于外泌體這樣的研究對象來說是非常重要的。

NTA也能對樣品濃度進(jìn)行直接測量。對一系列濃度為1×108

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8×108的100納米單分散樣品進(jìn)行測量，可以看到NTA測量濃度結(jié)果和實際濃度存在著很好的線性相關(guān)(圖3B)。對于多分散體系，測量結(jié)果的準(zhǔn)確取決于儀器參數(shù)的設(shè)定(照相機(jī)快門速度和光圈)，恰當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定可以保證不同大小顆粒都能被NTA軟件追蹤和計算。30精品課件31精品課件由于外泌體外表有標(biāo)志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復(fù)雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標(biāo)記外泌體，再用NTA的熒光測量功能實現(xiàn)在復(fù)雜背景下對外泌體的測量。相比較于流式細(xì)胞儀的熒光功能，NTA分辨率較高，且測量熒光顆粒的下限可以到達(dá)30-40納米，而流式細(xì)胞儀的測量下限為400納米。即使對于最新一代的數(shù)碼流式細(xì)胞儀，其測量下限已經(jīng)到達(dá)100納米，但由于它仍然建立在監(jiān)測光信號的根底上，所以測量和準(zhǔn)確性和分辨率仍