rp-hplc法測(cè)定熱風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量

rp-hplc法測(cè)定熱風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量

風(fēng)藤是茄子科的一種獨(dú)特植物，在中國(guó)廣泛種植。在三峽地區(qū)，巴東、酉陽(yáng)、扶桂、興山和杏花分布在三峽地區(qū)的大部分地區(qū)。風(fēng)藤也是人們非常廣泛使用的流行中藥。在本實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)湖北恩施風(fēng)藤的化學(xué)成分進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)活性的研究。結(jié)果表明，它們中的氨基酸具有顯著的抗炎性，而番堿是含量較大的成分。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告，從風(fēng)藤正丁醇部分的水不溶部分中分離出的番堿，采用ep-hplc精制，以威廉液相色譜法測(cè)定了全氮范堿的含量。本研究還對(duì)全氮范堿進(jìn)行了測(cè)定，采用了高效液相色譜法測(cè)定了全氮范堿的含量。用甲醇超聲輔助提取物測(cè)定，提取物濃縮，放入水中，用乙酸乙酯萃取，去除弱電阻滯，部分過(guò)濾水相，過(guò)濾后樣品用甲醇溶解。利用高效液相色譜法測(cè)定了空氣中的浮游生物含量，為更好地利用傳統(tǒng)的中藥風(fēng)藤提供了科學(xué)依據(jù)。1材料和機(jī)器1.1對(duì)照品溶液的制備排風(fēng)藤:于2010年10月采自中國(guó)湖北恩施,其原植物標(biāo)本采自同一地區(qū),經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室楊進(jìn)副教授鑒定為Solanumcathayanu,原植物及藥材現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室(編號(hào):SC201010ES).對(duì)照品:番茄堿,為本實(shí)驗(yàn)室自排風(fēng)藤中分離得到,并經(jīng)波譜學(xué)解析(NMR,ESI-MS)并結(jié)合文獻(xiàn)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為番茄堿,以HPLC面積歸一化法測(cè)定,純度>98%.對(duì)照品溶液:準(zhǔn)確稱取番茄堿對(duì)照品適量,加甲醇配制成濃度約為1.0mg·mL-1的貯備液,臨用時(shí)以甲醇稀釋成0.10、0.15、0.25、0.40、0.50、0.60mg·mL-1的系列對(duì)照品溶液.1.2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器Prostar210型高效液相色譜儀(美國(guó)瓦里安Varian);N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);ME215S型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius);KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).2方法2.1色譜柱和檢測(cè)條件對(duì)自排風(fēng)藤正丁醇水不溶部分分離得到的粗番茄堿采用HPLC精制分離.色譜條件:YMC-PackODS-AA(250×10mm,5μm)色譜柱;柱溫30℃;流速4mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)203nm;流動(dòng)相為乙腈-水(90∶10,v·v-1).番茄堿色譜峰保留時(shí)間42.6min.將上述制備得到的流分減壓濃縮,干燥得精制番茄堿,經(jīng)面積歸一化法測(cè)定純度為98.2%.2.2番堿含量分析2.2.1柱溫度和流動(dòng)相YMC-PackODS-AA(150×4.6mm,5μm)色譜柱;流速1mL·min-1;柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈-水(90∶10,v·v-1);檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;在此色譜條件下,對(duì)照品與供試品的保留時(shí)間一致(42.6min),供試品中番茄堿成分達(dá)到有效分離,分離度大于1.5.對(duì)照品及供試品的色譜圖如圖1所示.2.2.2供試品溶液的制備分別精密稱取干燥的排風(fēng)藤莖、葉、果粉末2g,加入25mL甲醇室溫冷浸4h,于60℃下超聲浸提60min,過(guò)濾,濾液減壓濃縮至干,加入20mL水懸浮,用20mL乙酸乙酯萃取,分取水層,過(guò)濾,濾渣用10mL甲醇溶解,定容.以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,得供試品溶液,低溫保藏備用.3結(jié)果與分析3.1堿對(duì)照品的hplc圖譜分別精密吸取各番茄堿對(duì)照品溶液20μL進(jìn)樣,按2.2.1中色譜條件測(cè)定色譜峰面積(番茄堿對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖a),以峰面積Y為縱坐標(biāo),濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制工作曲線,并進(jìn)行線性回歸.結(jié)果表明,在對(duì)照品濃度為0.10～0.60mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:Y=5.0145×107X-0.2486,r=0.9997.3.2儀器精密度試驗(yàn)精密吸取0.10、0.25、0.60mg·mL-1的對(duì)照品溶液各20μL,按2.2.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,測(cè)定色譜峰面積,計(jì)算RSD為2.60%(n=9),表明儀器精密度良好.3.3葉部位平均峰面積測(cè)定取排風(fēng)藤莖葉果各部位粉末約2.0g,每個(gè)部位6份,精密稱定.按2.1方法平行制備,按2.2.1色譜條件下進(jìn)行分析,測(cè)定莖部位的平均峰面積為7234412,RSD為2.60%;葉部位的平均峰面積為3237136,RSD為2.40%;果部位的平均峰面積為6749496,RSD為2.80%.3.4進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取排風(fēng)藤莖部位供試品溶液20μL,于0、4、12、24、36、48h分別進(jìn)樣,測(cè)定其平均峰面積為7084945,其RSD值為1.67%(n=6),表明48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好.3.5加樣回收率和rsd精密稱取已知番茄堿含量的樣品9份(排風(fēng)藤莖部位樣品),平均分為3組.各樣品分別精密加入已知濃度的對(duì)照品溶液適量,按供試品溶液制備方法平行制備.按2.2.1中色譜條件,分別進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定,得平均回收率為97.6%(n=9),RSD為2.93%.結(jié)果見(jiàn)表1.3.6重新確定番茄堿的含量按2.2.1中色譜條件測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量.排風(fēng)藤莖葉果部位供試液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1.測(cè)得排風(fēng)藤莖部位中番茄堿的含量為1.104mg·g-1,RSD為2.60%;排風(fēng)藤葉部位中番茄堿的含量為0.494mg·g-1,RSD為2.40%;排風(fēng)藤果部位中番茄堿的含量為1.030mg·g-1,RSD為2.80%;以莖部位中番茄堿含量最高.4室內(nèi)模樣測(cè)定和驗(yàn)證本文對(duì)采用系統(tǒng)分離方法得到的排風(fēng)藤正丁醇部位中水不溶部分經(jīng)正相硅膠柱層析后,重結(jié)晶純化得到的粗番茄堿進(jìn)行HPLC精制,采用超聲輔助浸提的方法制備排風(fēng)藤供試品,并且以精制得到的番茄堿為對(duì)照品,建立了RP-HPLC法測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量.測(cè)得排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量分別為1.104mg·g-1、0.494