杜長大斷奶仔豬試驗條件的選擇

杜長大斷奶仔豬試驗條件的選擇

為了最大限度地提高經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)代仔豬環(huán)境中的早期斷奶技術(shù)通常被采用，但也帶來了新的問題?！霸缙跀嗄套胸i風(fēng)險綜合征”就是其中之一。主要包括由營養(yǎng)、免疫、心理和環(huán)境刺激引起的仔豬食欲差、消化功能紊亂、生長緩慢、腹瀉、飼料利用率低、競爭力低、死亡率高等問題。為此,在生產(chǎn)中普遍從營養(yǎng)方面入手,在飼料中添加利高霉素、桿菌肽鋅、金霉素等抗生素作為飼料添加劑,對于控制疾病的發(fā)生、降低飼料增重比、促進(jìn)動物生長、降低腹瀉等方面具有良好的效果,但是長期利用抗生素容易造成藥物殘留、細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、環(huán)境污染、畜產(chǎn)品質(zhì)量和安全等問題。隨著人們對畜產(chǎn)品質(zhì)量和安全問題的日益關(guān)注,世界各國對抗生素使用的逐步全面禁止,人們尋找高效、安全抗生素替代品的愿望日益迫切,綠色飼料添加劑的研究也開始備受矚目。其中,中草藥因其具有來源天然、資源廣泛、成本低廉、長期使用無殘留、無毒副作用、藥效不減、不易產(chǎn)生耐藥性等特點而備受青睞。中草藥作為新型安全的生物飼料添加劑,具有促進(jìn)畜禽生長、抑制病原菌、增強免疫功能、提高抗病力等功效。結(jié)合本課題組前期的試驗成果,本試驗設(shè)計復(fù)方中草藥的不同添加劑量,研究不同劑量的中草藥添加劑對早期斷奶仔豬生長性能、抗腹瀉效果和腸道微生物的影響,篩選出中草藥提取物的最優(yōu)添加劑量,并為將其開發(fā)為一種環(huán)保、高效、安全的免疫促生長飼料添加劑提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1復(fù)方中草藥以干草粉或干草試驗中草藥復(fù)方組成為金銀花、黃芪、茯苓、枸杞、馬齒莧等。中草藥復(fù)方分為提取(主要為黃芪、茯苓、馬齒莧等)和不提取部分(主要為枸杞、金銀花等),提取部分、不提取部分比例為3∶1。不提取部分復(fù)方中草藥在65~70℃下烘干后,60目粉碎并于-20℃保存;提取部分采用醇-水提取法,首先復(fù)方中草藥經(jīng)65~70℃烘干后,40目粉碎過篩,并用50%的酒精浸泡36h以上,每一份藥經(jīng)冷凝回流3次,每次2h,藥渣用200目的尼龍紗布過濾,并經(jīng)人工擠壓(盡量減少藥渣內(nèi)中藥有效成分的殘留),濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收其中的酒精并濃縮藥液,提取物保存在4℃冰箱中。1.2中草藥添加劑對斷仔日糧蛋白質(zhì)含量的影響選擇優(yōu)質(zhì)玉米和豆粕,經(jīng)65℃烘干,粉碎至40目,并按7∶4的比例混勻,作為中草藥添加劑預(yù)混料的載體,其蛋白質(zhì)的含量與斷奶仔豬日糧相當(dāng)。2個對照載體中分別加入中草藥添加劑和抗生素(20mg/kg硫酸粘桿菌素+100mg/kg桿菌肽鋅;硫酸粘桿菌素純度10%,桿菌肽鋅純度15%)。中草藥預(yù)混料再經(jīng)65℃烘干,并粉碎至40目,按4∶2∶1分成3份,后2份按一定比例加入載體并混勻后備用,保存在干燥通風(fēng)的地方。1.3飼養(yǎng)次數(shù)及培養(yǎng)條件本試驗在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧試驗基地完成。飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場的規(guī)定,每天飼喂3次(08:00、12:00、16:00),自由飲水,每次喂料要保證有一定量的剩余,并保證保育室中良好的衛(wèi)生防疫條件。注意觀察仔豬的采食、腹瀉情況,試驗期間腹瀉仔豬不用藥物治療。1.4分組及日糧添加量選擇健康無病的28日齡杜長大斷奶仔豬135頭,初始體重為(6.76±0.89)kg,并按體重、性別、窩別一致原則隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分成5組,每組分3欄,每欄9頭。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%、1.0%、2.0%的中草藥提取物;抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加20mg/kg硫酸粘桿菌素和100mg/kg桿菌肽鋅,各組基礎(chǔ)日糧及營養(yǎng)成分相同(見表1)。試驗從斷奶開始,全期共35d,其中預(yù)試期7d,正試期28d。1.5空腹稱重及一般日食量在正試期第1、14天和28天08:00空腹稱重,并計算采食量;分別計算各階段各處理日平均采食量(ADFI)、日增重(ADG)和飼料增重比(F/G)。1.6糞樣的品種每日觀察3次(早、中、晚各1次)仔豬腹瀉情況,其糞便情況大致分為4種,分別是正常糞便、不成形糞便、稠狀液體糞便、稀的液體狀糞便。出現(xiàn)后2種情況糞便的仔豬視作腹瀉。正試期開始每日記錄每組腹瀉仔豬頭數(shù),計算腹瀉率:腹瀉率=腹瀉仔豬總頭日數(shù)/(試驗總仔豬頭數(shù)×試驗總天數(shù))×100%。1.7腸微生物范圍1.7.1糞樣的采集和保存正試期第28天晨飼前,各組隨機(jī)選取5頭仔豬,從肛門處無菌采集糞樣。樣品中添加15%的甘油于-20℃下保存。在DNA提取前,解凍樣品,移去液相稱取200mg濕重的糞樣,用于DNA的提取。1.7.2pcr引物采用糞便DNA純化試劑盒(Simgen,杭州),提取糞便總DNA。隨后對細(xì)菌的16SrDNA的V6-V8區(qū)片段進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR引物為帶有GC夾子的U968-GC(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′)和L1401(5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′)。吸取5μL產(chǎn)物,進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳,電泳結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker進(jìn)行比對,片段長度為470bp左右。1.7.3凝膠電泳檢測dage分析參照文獻(xiàn),對細(xì)菌16SrDNA的V6-V8可變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝膠(含丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),其中尿素濃度梯度為35%~55%。電泳采用美國CBS2401變形梯度凝膠電泳儀,使用0.5×TAE緩沖溶液,先在200V電壓下預(yù)電泳10min,隨后在120V的固定電壓下電泳16h。電泳結(jié)束后,立即進(jìn)行硝酸銀染色,凝膠經(jīng)密度校正儀(Bio-Rad,Gs-800)掃描。DGGE凝膠用QuantityOne4.6.3軟件(Bio-Rad,美國)進(jìn)行菌群相似性和多樣性分析。包括豐富度(S),即DGGE圖譜每條泳道的條帶數(shù);微生物區(qū)系多樣性指數(shù),Shannon-Wiener指數(shù)(H′),采用UP-GMA相似性聚類分析。按照如下公式進(jìn)行計算其中,Pi為泳道中i條帶出現(xiàn)的可能性;Pi=ni/H,ni為某1條帶的峰高,H為泳道密度曲線所有峰高的總和。1.7.4在dgge手冊中，對一些優(yōu)勢條帶的研究順序進(jìn)行分析1.8統(tǒng)計分析采用SAS軟件的GLM程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,各試驗組之間參數(shù)采用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。2結(jié)果與分析2.1生長性能2.2各組大鼠血清第1、4周、第3周的試驗結(jié)果由表3可見,正試期第1、3、4周,試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組仔豬的腹瀉率較對照組均有顯著下降(P<0.05),且第1、4周與抗生素組差異不顯著(P>0.05),第3周試驗Ⅱ組與抗生素組無顯著差異(P>0.05);第2周及試驗全期,試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組仔豬的腹瀉率極顯著低于對照組(P<0.01),且均與抗生素組無顯著差異(P>0.05)。2.3srrna序列及聚類分析如圖1所示,為仔豬直腸糞樣DGGE圖譜,圖譜上的泳帶反映了糞樣中的優(yōu)勢菌群,泳帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性說明了菌群的多樣性。處理組內(nèi)和組間仔豬的直腸微生物DGGE圖譜具有很多相同泳帶。經(jīng)過DGGE圖譜各條泳帶之間的比較,可以發(fā)現(xiàn)3個特異性條帶(a、b、c),其中,a條帶為所有中草藥組共有,b、c條帶為0.5%和1.0%中草藥組特有?；蛐蛄蟹治霰砻?a、b、c條帶的16SrDNA片段序列長度分別為395、393、579bp,與基因數(shù)據(jù)庫登錄的相關(guān)序列的相似性分別為96%、90%、93%,這3個特異條帶所對應(yīng)的細(xì)菌分別為1.0%組的非培養(yǎng)真桿菌和1.0%組的HS-136枯草芽孢桿菌(Bacillussp.HS-136partial16SrRNAgene,strainHS-136)、0.5%組的非培養(yǎng)真桿菌。從DGGE圖譜的條帶數(shù)來看(圖2),對照組、0.5%和1.0%中草藥組都顯著多于抗生素組(P<0.05);其中,0.5%組顯著多于對照組、1.0%和2.0%組(P<0.05),且顯著多于抗生素組(P<0.01)。通過計算各試驗組DGGE圖譜中泳道中條帶的H′指數(shù)(圖3),可以發(fā)現(xiàn)對照組和中草藥各組都顯著高于抗生素組(P<0.05);其中以0.5%組多樣性指數(shù)最高。由圖4可見,通過UPGMA相似性聚類分析,所有的條帶數(shù)分為2類,其中Ⅰ類(除了20號)為空白組和抗生素組的DGGE圖譜,相似性指數(shù)大都低于60%,甚至更低;所有中草藥組的DGGE圖譜大都?xì)w為第Ⅱ類(除5號和23號),并且相似性都大于60%。3討論3.1復(fù)方中草藥提取物對斷裂強度的影響中草藥提取物中含有多種生物活性成分,按一定比例添加于基礎(chǔ)日糧中,可以增加動物的營養(yǎng),增強機(jī)體的新陳代謝,提高機(jī)體免疫力,從而使得動物健康快速的生長。本試驗采用金銀花、黃芪、茯苓、枸杞等多味中藥配伍,其主要有效成分為多糖、黃酮類、有機(jī)酸、生物堿和揮發(fā)類物質(zhì)等。復(fù)方中草藥提取物能夠有效地提高斷奶仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。有研究在玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧中添加2g/kg中草藥超微粉末,結(jié)果表明,21日齡斷奶仔豬日增重、采食量較空白組分別顯著提高19%、20%,第3周飼料增重比顯著降低11.00%。本研究的結(jié)果同前幾位研究者的結(jié)果相似,中草藥組與對照組相比,ADFI和ADG都有增加,并且ADFI、ADG和F/G與抗生素組均無顯著差異,其中0.5%中草藥的作用效果與抗生素組較為接近,這可能是由于高劑量的中草藥會影響飼料的氣味,從而減少了仔豬的采食量,一定程度上抑制了仔豬的生長。3.2中草藥添加劑對東南角腹瀉的影響本試驗的復(fù)方中草藥由理氣健脾的枸杞和茯苓、清熱抗菌的金銀花、補氣殺蟲的黃芪和馬齒莧配伍而成,能夠改善動物消化系統(tǒng),降低斷奶仔豬的腹瀉,從而提高飼料的消化吸收,最終促進(jìn)動物的生長發(fā)育。饒駿等研究了中草藥添加劑與土霉素對榮昌仔豬腹瀉的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中草藥配方2(黃芪∶制首烏∶神曲∶淫羊藿=3∶2∶3∶3)的效果最好,腹瀉率比對照組降低了11.03%,略優(yōu)于抗生素組。日糧中添加超微粉碎中草藥,腹瀉率在試驗期的第2周和第3周顯著下降,特別是在第3周,2.0g/kg超微粉碎中草藥的抗腹瀉效果顯著優(yōu)于抗生素。從本試驗的結(jié)果來看,復(fù)方中草藥可以有效地降低斷奶仔豬腹瀉率,低劑量的中草藥添加劑效果接近于抗生素。這可能是由于中草藥提取物能夠有效調(diào)理腸胃,改善腸道微生物菌落,進(jìn)而提高機(jī)體的免疫功能,減少應(yīng)激反應(yīng),最終降低仔豬腹瀉的發(fā)生。3.3藥組大鼠dage圖譜從生長性能來看,0.5%中草藥組仔豬的生長性能與抗生素作用效果相當(dāng);復(fù)方中草藥對斷奶仔豬腹瀉的治療效果接近于抗生素;飼喂復(fù)方中草藥對仔豬直腸微生物區(qū)系產(chǎn)生了一定的影響,提高了直腸菌群數(shù)量,促進(jìn)了有益菌的生長。這可能與復(fù)方中草藥具有調(diào)理腸胃、殺菌抑菌、提高機(jī)體免疫力有關(guān),然而抗生素在殺滅有害菌的同時,也可能會抑制有益菌的生長。本研究發(fā)現(xiàn),抗生素可以減少仔豬直腸細(xì)菌數(shù)量,且組內(nèi)動物之間腸道細(xì)菌相似性下降。而在中草藥組仔豬的DGGE圖譜上發(fā)現(xiàn)了3個特異性條帶,為2種細(xì)菌,分別為枯草芽孢桿菌和非培養(yǎng)真桿菌?？莶菅挎邨U菌作為有益菌,是由一類在逆境下可以形成休眠體芽孢以抵抗不良環(huán)境的好氧革蘭氏陽性菌,特點是耐酸、耐鹽、耐高溫和耐擠壓,并可以產(chǎn)生多種酶類,如蛋白酶、淀粉酶、脂酶等。它的生物作用包括生物奪氧,抑制有害菌;拮抗病原微生物,維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡;產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物;增強免疫機(jī)能,提高抗病能力。芽孢桿菌可競爭性抑制病原微生物黏附到腸黏膜上皮細(xì)胞上,同病原微生物爭奪有限的營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位點。并且芽孢桿菌在胃腸道上部可產(chǎn)生乳酸、丙酸、乙酸等物質(zhì)使得腸道內(nèi)的pH降低,在腸道下部產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,抑制有害微生物的生長,并有助于動物特別是幼小動物營養(yǎng)物質(zhì)的消化,尤其是蛋白質(zhì)的消化吸收。真桿菌也是一種有益菌,具有抑制外來菌的作用,具備完全的有益作用,在胃腸道合成維生素和蛋白質(zhì),輔助消化吸收,抑制病原微生物生長,刺激和興奮免疫系統(tǒng)。目前國內(nèi)外對于真桿菌的作用機(jī)理報道較少。本試驗中,枯草芽孢桿菌HS-136僅存在于0.5%和1.0%復(fù)方中草藥組中,真桿菌則來自中草藥各個添加劑量組,這可能與復(fù)方中草藥兼具藥用和營養(yǎng)的雙重功效有關(guān),并且復(fù)方中草藥