犬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

犬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

輔助生殖技術(shù)是利用人工方法幫助男性和卵之間的結(jié)合的技術(shù)。它可以分為：ivm）、精細(xì)保存；ivf）、工藝精湛；ai）和胚胎移植（et）。輔促生殖技術(shù)在牛羊等一般家畜生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用,而在犬上的應(yīng)用研究相對(duì)落后。筆者對(duì)犬輔助生殖技術(shù)的研究進(jìn)行了綜述。1元素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的活性影響犬屬單次發(fā)情動(dòng)物,發(fā)情前期和發(fā)情期長(zhǎng)是區(qū)別于其他哺乳動(dòng)物的一大特點(diǎn)。由于排卵時(shí)間不易掌握,難以獲得自然排出的卵母細(xì)胞,這給犬的體外受精和胚胎發(fā)育研究造成極大困難。通過(guò)卵巢卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)獲取大量成熟卵母細(xì)胞,然后體外受精獲得胚胎的方法越來(lái)越受到人們重視。目前有關(guān)IVM的研究報(bào)道較多,內(nèi)容主要集中在篩選培養(yǎng)液組成成分的研究方面。常用犬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液大致可分為2種:單純培養(yǎng)液和混合培養(yǎng)液。廣泛使用的單純培養(yǎng)液主要有改良KredsRinger重碳酸鹽溶液(mKRB)和人工合成輸卵管液(SOF);混合培養(yǎng)液主要是TCM199。目前混合培養(yǎng)液TCM199被認(rèn)為是犬卵母細(xì)胞培養(yǎng)的最好基礎(chǔ)培養(yǎng)液。雖然在犬的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液研究中有一定進(jìn)展,但是犬的IVM成功率不高,通常只有20%。制約犬IVM成功率的因素主要是:(1)卵母細(xì)胞的形態(tài)。TheissT的研究表明,卵母細(xì)胞的直徑、細(xì)胞質(zhì)色澤、胞漿內(nèi)鞭毛的發(fā)育程度或透明帶破裂與否等都對(duì)犬卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)產(chǎn)生影響。HewittDA研究發(fā)現(xiàn)直徑>100μm的IVM成熟率(19%)高于直徑≤100μm(10%)的卵。(2)顆粒細(xì)胞的完整性。犬卵母細(xì)胞核成熟的完成與顆粒細(xì)胞的擴(kuò)散程度呈負(fù)相關(guān)。顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起合成類(lèi)固醇激素的作用,同時(shí)顆粒細(xì)胞中還存在各種促使卵母細(xì)胞發(fā)育的激素受體,顆粒細(xì)胞擴(kuò)散或崩解會(huì)阻斷FSH和LH等激素對(duì)卵母細(xì)胞的作用途徑,進(jìn)而影響IVM。(3)培養(yǎng)液中激素添加劑。SrsenV等研究發(fā)現(xiàn),在整個(gè)培養(yǎng)期使用促性腺激素(FSH/LH1ug/mL的聯(lián)合或單獨(dú)使用)并不能提高核成熟率;Rodrigues等還發(fā)現(xiàn),無(wú)FSH的培養(yǎng)液可防止卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的中斷,但對(duì)隨后減數(shù)分裂的進(jìn)行并無(wú)促進(jìn)作用;而Songsasen等最近的研究顯示,將犬的卵母細(xì)胞暴露在eCG(馬絨毛促性腺激素)中60～240min,能使減數(shù)分裂的恢復(fù)率和進(jìn)入MI期的百分率提高,這種有利影響可能是由于eCG的FSH活性作用。但Hanna等實(shí)驗(yàn)表明,添加eCG對(duì)犬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂和達(dá)到MII期的比率比對(duì)照組要低,eCG能促進(jìn)卵丘擴(kuò)散,是減數(shù)分裂的抑制劑。這可能是由于促性腺激素對(duì)犬顆粒細(xì)胞合成類(lèi)固醇激素的作用時(shí)間不同。添加促性腺激素的效應(yīng)可能也受到培養(yǎng)液中類(lèi)固醇激素的影響,這些激素之間的復(fù)雜關(guān)系更好地反映了排卵前卵泡的生理環(huán)境。但有報(bào)道,在2種濃度的雌二醇與促性腺激素聯(lián)合使用時(shí),對(duì)卵母細(xì)胞的成熟并未顯示任何影響。(4)培養(yǎng)液中蛋白因子添加劑。通常在培養(yǎng)液中添加的蛋白因子主要是熱滅活血清或血清白蛋白,血清通過(guò)促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖,增強(qiáng)顆粒細(xì)胞功能及刺激卵丘擴(kuò)散等一系列機(jī)制影響IVM。OtoiT在犬的IVM研究中添加超過(guò)10%的胎牛血清(FCS)可以提高卵母細(xì)胞的成活率,而對(duì)其成熟無(wú)有利影響。以前血清多用FCS,現(xiàn)在部分學(xué)者主張用發(fā)情動(dòng)物的血清(EDS),認(rèn)為其中含有較高激素濃度和更合理的激素組合。研究表明,同時(shí)添加EDS和FSH可提高成熟率,證明兩者有協(xié)同作用。比較添加發(fā)情犬和發(fā)情牛血清,發(fā)現(xiàn)添加發(fā)情犬血清對(duì)于犬卵母細(xì)胞成熟至MI-AI期的效果優(yōu)于添加發(fā)情牛血清(10.4%～4.2%),但兩者均未能使卵母細(xì)胞成熟至MII期。而OtoiT等用10%的發(fā)情犬血清使卵母細(xì)胞完全成熟的比率達(dá)16.3%,而乏情犬血清只有11.1%。血清中成分比較復(fù)雜,除了含有蛋白質(zhì)外,還含有促性腺激素、類(lèi)固醇激素、生長(zhǎng)因子等因子。因此難以確定在添加血清后究竟是哪種促進(jìn)了卵母細(xì)胞的成熟。而且血清不同批次產(chǎn)品差異較大,導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果不一。2精子保護(hù)和人類(lèi)生產(chǎn)2.1萃取精華3發(fā)發(fā)運(yùn)炎對(duì)卵母細(xì)胞的影響由于犬排卵時(shí)間不易掌握,難以獲得自然排出的卵母細(xì)胞,這給犬的體外受精和胚胎發(fā)育研究造成極大困難。有關(guān)犬卵母細(xì)胞IVF的研究報(bào)道較少。MahiC.A.等利用自然發(fā)情犬卵巢上的囊狀卵泡的卵母細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)和體外受精,獲得原核胚;S.Yamada等利用誘發(fā)發(fā)情犬卵巢上囊狀卵泡進(jìn)行體外成熟和IVF,獲得8細(xì)胞胚胎,但成熟率、受精率和卵裂率都很低。陳振文等就發(fā)情犬與未發(fā)情犬的卵母細(xì)胞對(duì)IVF的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,認(rèn)為發(fā)情犬卵巢卵母細(xì)胞單精受精率和原核形成率顯著高于未發(fā)情犬卵巢卵母細(xì)胞,而兩者的不可見(jiàn)卵泡卵母細(xì)胞的單精受精率和原核受精率基本相同。因而推測(cè)發(fā)情犬卵母細(xì)胞受精率高于未發(fā)情犬的卵母細(xì)胞的原因是,可見(jiàn)卵泡中的卵母細(xì)胞發(fā)育能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不可見(jiàn)卵泡中的卵母細(xì)胞。到目前為止,還沒(méi)有建立適合犬卵母細(xì)胞較優(yōu)化的體外受精系統(tǒng)。4體外受精的胚胎、體外受精的犬后胚胎移植胚胎移植是指一只雌性供體發(fā)情并經(jīng)配種后,在一定時(shí)間內(nèi)從其生殖道取出胚胎,或經(jīng)體外受精獲得胚胎,移植到另一只與供體同時(shí)發(fā)情但未配種的受體動(dòng)物生殖道相應(yīng)部位。受體子宮要處于能夠接受異體胚胎的合適條件,外來(lái)胚胎在受體子宮著床繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育,最后產(chǎn)下供體后代。在犬科動(dòng)物胚胎移植中,供體和受體發(fā)情同期化是很難解決的。因犬科動(dòng)物用外源激素處理很難得到滿(mǎn)意的結(jié)果,所以要在一個(gè)很大的受體群中選擇,采取手術(shù)法,將胚胎移植給受體。犬科動(dòng)物胚胎移植如狗胚胎移植,國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少,尚無(wú)應(yīng)用于生產(chǎn)的成熟胚胎移植技術(shù),僅有子宮移植的數(shù)例報(bào)道,還未見(jiàn)有輸卵管胚胎移植的報(bào)道。KinneyGM等報(bào)道將8個(gè)桑椹胚植入受體犬的子宮后產(chǎn)下2只幼仔;TsutsuiT等報(bào)道手術(shù)采集發(fā)情后14～15d的5只供體的28枚胚胎,將這些胚胎再分別植入5只自然發(fā)情的母犬子宮內(nèi),其中有2只受體犬受孕,各自產(chǎn)下2只幼仔;KraemerD.C.等也有胚胎移植后產(chǎn)下活仔的報(bào)道;董君艷等也報(bào)道將供體胚胎取出后移植給2只自然發(fā)情受體犬成功受孕,并產(chǎn)下3只幼仔?，F(xiàn)有的幾例子宮胚胎移植試驗(yàn)均在自然發(fā)情的母犬上獲得成功,存在供受體很難同步化、胚胎回收率低、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等難題,因此,還處于起步和摸索階段。影響犬胚胎移植的因素很多,涉及生理、內(nèi)分泌、遺傳、免疫和環(huán)境因素等。其中胚胎的質(zhì)量、胚胎在體外停留的時(shí)間、胚胎的發(fā)育階段、手術(shù)沖卵的時(shí)間、手術(shù)操作的規(guī)范和熟練程度、供受體的營(yíng)養(yǎng)狀況等在犬的胚胎移植中具有重要影響。相對(duì)于子宮胚胎移植而言,犬的輸卵管胚胎移植意義更為重大,因?yàn)闃?gòu)建轉(zhuǎn)基因犬和克隆犬需要成熟的輸卵管胚胎移植技術(shù)作為基礎(chǔ),而僅有犬子宮移植的幾例成功報(bào)道,在技術(shù)上不足以支撐轉(zhuǎn)基因犬和克隆犬的創(chuàng)建?？v觀(guān)國(guó)內(nèi)外犬輔助生殖技術(shù)的研究現(xiàn)狀,目前已成功應(yīng)用于其他家畜的輔助生殖技術(shù)在犬中研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。自20世紀(jì)90年代以來(lái),犬的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)、精液保存和人工授精、體外受精、犬的子宮胚胎移植等方面均獲得突破。雖然成功率很低,但是這些突破為進(jìn)一步開(kāi)展犬的輔助生殖技術(shù)研究帶來(lái)了希望,提供了可供參考的理論基礎(chǔ)和操作依據(jù)。精液保存技術(shù)是精、卵在體外結(jié)合和人工授精的基礎(chǔ),沒(méi)有有效的精液保存技術(shù),很難將人工授精技術(shù)推廣應(yīng)用,也很難獲得體外受精的受精卵。目前對(duì)于犬精液的保存主要參照一般家畜的精液保存方法,同時(shí)也在積極篩選適合犬精液保存的保存液。犬精液保存依據(jù)人工授精技術(shù)要求分為液態(tài)保存和冷凍保存。李彩霞等認(rèn)為短期保存犬精液選用液態(tài)保存較為合適,冷凍保存適宜長(zhǎng)期保存。張居農(nóng)等分析認(rèn)為犬精液稀釋液主要包括4種成分,即:(1)能量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如葡萄糖、卵黃、甘氨酸、牛奶、果糖;(2)緩沖物質(zhì),如檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、磷酸鉀;(3)防凍劑,如卵黃、糖類(lèi);(4)酶制劑、抗菌素,如過(guò)氧化氫酶、青鏈霉素。禹學(xué)禮等在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,建立了一種冷凍犬顆粒精液的新方法——“炸熏法”,將精液直接滴入液氮,5～8s后將顆粒撈出,繼續(xù)在液氮上方2cm的銅紗網(wǎng)上熏蒸6min。經(jīng)與其他冷凍方法對(duì)比后認(rèn)為,精子的平均凍后活力、精子的平均頂體完整率均有明顯提高。目前利用液態(tài)保存和冷凍保存的犬精液進(jìn)行人工授精均已獲得成功,但是稀釋液篩選和保存技術(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn),以期獲得可以方便用于生產(chǎn)的精液保存方法。2.2復(fù)配單株在德國(guó)專(zhuān)物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)ames結(jié)果一些發(fā)達(dá)國(guó)家犬冷凍精液與AI的研究起步早、進(jìn)展快,目前已得到廣泛應(yīng)用。我國(guó)在這方面的研究起步較晚,目前尚處于試驗(yàn)研究階段。潘壽文等首先對(duì)德國(guó)牧羊犬的冷凍精液和AI成功進(jìn)行了試驗(yàn),輸精9條母犬,2條懷孕,受胎率為22%,平均窩產(chǎn)仔2條;洪振銀等利用凍精為9條母犬輸精,受胎產(chǎn)仔結(jié)果同上;王力波等對(duì)德國(guó)牧羊犬的凍精AI