精子dna損傷與宮腔內(nèi)人工授精妊娠率的關(guān)系

精子dna損傷與宮腔內(nèi)人工授精妊娠率的關(guān)系

輔助生殖技術(shù)（ai）的應(yīng)用越來越廣泛。宮內(nèi)內(nèi)的生殖器官檢測(cè)（iui）是治療虐待性移民（妊娠）疾病的常用方法。適應(yīng)性癥狀主要包括輕度少弱性酒精、宮頸疾病、反射性避孕和非個(gè)體經(jīng)育障礙，成功率為5%-66%。目前認(rèn)為,精子濃度、精子活動(dòng)力、精子畸形率等參數(shù)雖不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)IUI妊娠結(jié)局,卻是選擇IUI還是IVF或者ICSI治療的重要依據(jù)。很多患者精子參數(shù)輕度異?；蛟谡７秶?但經(jīng)歷多個(gè)IUI周期并不能妊娠,最終需要IVF甚至ICSI治療。所以,臨床迫切需要某些精子參數(shù)指標(biāo),能更有效地預(yù)測(cè)IUI的妊娠結(jié)局,從而避免反復(fù)的IUI治療,幫助患者選擇經(jīng)濟(jì)有效的ART方案。研究發(fā)現(xiàn),不育男性精子染色質(zhì)缺陷和DNA斷裂率較生育男性要高。精子DNA缺陷可能影響ART成功率,有研究認(rèn)為,精子DNA完整性的異常影響IUI妊娠結(jié)局。但是,也有學(xué)者認(rèn)為,精子DNA完整性的異常與IUI妊娠結(jié)局的關(guān)系有一定的局限性。精子核或DNA完整性的檢測(cè)方法有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(spermchromatinstructureassay,SCSA)、精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)(SCD)、彗星試驗(yàn)(COMET)、末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷(dUTP)末端標(biāo)記法(TUNEL)等。SCSA從上世紀(jì)80年代開始應(yīng)用于臨床,較其它幾種方法更為穩(wěn)定。SCSA檢測(cè)指標(biāo)為精子DNA碎片指數(shù)(DNAfractionationindex,DFI),研究發(fā)現(xiàn)DFI超過30%難以自然妊娠和通過IUI獲得妊娠,但亦有不同意見。國(guó)內(nèi)有報(bào)道,DFI與精子參數(shù)有一定相關(guān)性,不育癥男性DFI異常率較生育組高。DFI對(duì)IUI妊娠結(jié)局的影響,尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究DFI的臨床意義,評(píng)估其作為IUI妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)指標(biāo)的可行性,開展了本項(xiàng)研究。1精子scsa檢測(cè)1.1研究對(duì)象2009年11月至2010年11月在本院生殖醫(yī)學(xué)科實(shí)施IUI治療的482對(duì)不孕夫婦,其中女方年齡21～40歲,平均28歲;男方年齡21～40歲,平均28歲。男方精液洗滌前精子濃度>5×106/ml,洗滌后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)(totalprogressivemotilespermcount,TPMC)應(yīng)>1×107,低于此標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)交待成功率可能會(huì)下降并簽署相關(guān)知情同意書。女方的納入標(biāo)準(zhǔn):①女方年齡不超過40歲;②子宮輸卵管碘油造影或腹腔鏡證實(shí)至少一側(cè)輸卵管通暢;③超聲監(jiān)測(cè)有優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育及排卵。所有患者均簽署了知情同意書,并且該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。1.2精液采集、分析及制備在人工授精日手淫法采集精液,精子處理前后均分析精液,精子濃度采用Makler計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),精子活力評(píng)估參照世界衛(wèi)生組織頒布的指南。精液采集后1h內(nèi)吸取0.3～0.5ml精液凍存在-80℃冰箱以備將來行SCSA檢測(cè)。精液制備使用80%和40%的Puresperm(Nidacon,美國(guó))洗滌棄去上層液,將沉淀再次離心洗滌處理,收集沉淀混勻配制0.5ml備用。1.3SCSASCSA檢測(cè)精子DNA碎片的原理和操作方法主要根據(jù)Evenson等報(bào)道的方法進(jìn)行。精子酸暴露后染色質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷的精子DNA雙鏈變性成單鏈,吖啶橙染色后,沒有損傷的精子DNA保持雙鏈,吖啶橙結(jié)合則呈單體形式發(fā)出綠色熒光;受損的精子DNA雙鏈解鏈成單鏈,吖啶橙結(jié)合后呈聚合物發(fā)出紅色熒光。通過流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)精子熒光信號(hào),結(jié)合FCSExpress軟件(DeNovoSoftware,加拿大)計(jì)算,單個(gè)精子DFI值描述為紅色/(紅色+綠色)熒光強(qiáng)度×100%,即單個(gè)精子變性DNA占總DNA的比例;每份樣本至少檢測(cè)5000個(gè)精子,整份標(biāo)本的DFI值用主群以外精子所占百分比來表示,即DNA受損害的精子占總精子數(shù)的比例。1.4IUI治療配偶根據(jù)自身情況行自然周期IUI,或選擇促排卵藥物如克羅米芬(塞普路斯公司)、來曲唑(Leltozol,諾華制藥公司)、尿促性腺激素(hMG,麗珠公司)、果納芬(默克雪蘭諾公司)。B超持續(xù)卵泡監(jiān)測(cè),優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟后,肌肉注射hCG5000～10000IU,在注射hCG后的次日下午(24～36h)行IUI。有部分患者在卵泡直徑平均達(dá)到18mm后沒有注射hCG情況下自然排卵,則在監(jiān)測(cè)后的當(dāng)天下午行IUI治療。女方取膀胱截石位,暴露宮頸后,用1ml的注射器與一次性人工授精管(COOK公司)相連接,吸取精子混懸液,緩慢注入宮腔,抬高臀部保持仰臥位約20min。術(shù)后行常規(guī)黃體支持,2周后檢測(cè)血β-hCG,明確是否生化妊娠,4周后行B超示妊娠囊可見,則確定為臨床妊娠。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本文數(shù)據(jù)資料來源于江蘇省臨床生殖醫(yī)學(xué)管理系統(tǒng)(CCRM)。選用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,計(jì)量資料用xˉ±sxˉ±s表示,組間均數(shù)的比較用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示,采用χ2檢驗(yàn)。DFI的最佳分割點(diǎn)采用分類與回歸樹(classificationandregressiontree,CART)分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果用相關(guān)系數(shù)r表示,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素和多因素Logistic回歸分析研究DFI和前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)、夫婦年齡、女性身高體重指數(shù)(BMI)以及不孕年限對(duì)IUI生化妊娠率和臨床妊娠率的影響,結(jié)果描述為OR值和95%CI,在此基礎(chǔ)上繪制ROC曲線。2精子dfi與妊娠率關(guān)系的單因素分析2.1人精子FCMSCSA圖圖1和2是兩個(gè)有代表性的人精子SCSA圖,圖1DFI值在正常范圍(5.62%),圖2DFI值超過正常范圍(66.52%)。左圖為精子酸變性、AO染色后,綠熒光對(duì)紅熒光的二元變量細(xì)胞圖,每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)精子發(fā)出的紅和綠熒光坐標(biāo)。細(xì)胞碎片出現(xiàn)在圖中左下角,被排除在計(jì)算之外。變性DNA的范圍可通過紅熒光對(duì)總熒光的比值以生成的道數(shù)報(bào)告,范圍為0～1024。右圖是DFI分布直方圖,通過該直方圖計(jì)算DFI。2.2精子DFI的最佳分割點(diǎn)的確定采用分類與CART分析,結(jié)果表明,DFI的最佳分割點(diǎn)為25.27%,故本文以25%作為閾值進(jìn)行分組比較。見圖3。2.3不同周期精子DFI值的穩(wěn)定性482例患者中有54例患者采集2個(gè)周期的精液標(biāo)本分析DFI值的穩(wěn)定性,前后2個(gè)周期的DFI值分別為(15.05±7.98)%與(17.25±12.18)%,兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1個(gè)觀察周期有6例DFI超過25%,第2個(gè)觀察周期則有9例DFI超過25%,其中4例患者2個(gè)周期均超過25%,有5例患者第1個(gè)周期正常但第2個(gè)周期檢測(cè)異常。2.4DFI與精子參數(shù)的相關(guān)性482例患者入組后分析第1個(gè)IUI周期的精液標(biāo)本DFI與精子參數(shù)的相關(guān)性,結(jié)果顯示,精子DFI與精子濃度(r=-0.162)、a級(jí)精子百分率(r=-0.371)、b級(jí)精子百分率(r=-0.264)及TPMC(r=-0.3068)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。2.5482個(gè)IUI周期患者一般資料比較選擇482例患者入組后第1個(gè)IUI周期進(jìn)行分析(表1)。482例患者中DFI>25%的患者為95例,5例臨床妊娠,妊娠率為5.26%;DFI≤25%的患者為387例,57例臨床妊娠,妊娠率為14.73%。2組間雙方年齡、女方BMI、促排卵周期比例均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但不孕年限、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例、TPMC均有顯著性差異。2.6精子DFI、TPMC與妊娠率的相關(guān)性單因素Logistic回歸分析表明,DFI無論是與生化妊娠還是臨床妊娠均有關(guān)系,DFI升高將導(dǎo)致妊娠率下降,DFI>25%者,其生化妊娠率和臨床妊娠率只有DFI≤25%者的0.32(95%CI:0.12～0.79)和0.36(95%CI:0.13～0.86)倍;TPMC與生化妊娠、臨床妊娠亦均有關(guān)系,隨著TPMC總數(shù)的升高,妊娠率將增加。多因素Logistic回歸分析表明DFI和妊娠率關(guān)聯(lián)性仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),DFI>25%者,其生化妊娠率和臨床妊娠率只有DFI≤25%者的0.36(95%CI:0.14～0.94)和0.39(95%CI:0.16～0.96)倍。調(diào)整和不調(diào)整夫妻年齡、女性BMI和不孕年限,TPMC和DFI(按25%分類)均與生化妊娠和臨床妊娠顯著相關(guān)。見表2。3精子dfi檢測(cè)精子核高度致密,其DNA與魚精蛋白緊密結(jié)合,這樣可以將父方遺傳信息準(zhǔn)確無誤地導(dǎo)入卵,繼而傳給后代。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性對(duì)于受精和隨后胚胎發(fā)育非常重要,精子DNA損害如DNA碎片、染色質(zhì)組裝異常、魚精蛋白缺陷等達(dá)到一定程度,則導(dǎo)致妊娠率下降并影響胚胎發(fā)育。SCSA可以客觀地評(píng)價(jià)精液樣本精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性,操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性強(qiáng)。Evenson等認(rèn)為他們實(shí)驗(yàn)室的DFI閾值適用于其他按照SCSA標(biāo)準(zhǔn)程序操作的實(shí)驗(yàn)室。生育力正常男性精子參數(shù)正常,DFI值較低;而不育男性中精子參數(shù)異常,DFI值會(huì)升高,但有8%的不育男性盡管精子參數(shù)正常但精子DFI值異常升高,提示DFI還是一個(gè)獨(dú)立的生育力評(píng)估參數(shù)。不育男性有25%的精子DNA解鏈和28%的精子有DNA碎片,但生育力正常男性只有10%的精子DNA解鏈和13%的精子有DNA碎片。2008年的一份Meta分析顯示精子DNA損害和自然妊娠率之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。高水平的精子DNA損害導(dǎo)致IUI成功率下降,多個(gè)研究表明精子DNA完整性異常影響IUI妊娠結(jié)局。然而亦有研究表明,DFI有顯著的個(gè)體內(nèi)部差異,平均變異系數(shù)(CV)為29%,有很高比例的(37%,95%CI:27%～49%)患者在第1周期DFI>30%但在第2周期<30%;亦有27%(95%CI:16%～40%)的患者在第1周期DFI為21%～30%,但在第2周期>30%。本研究的54例患者前后2個(gè)周期DFI值分別為(15.05±7.98)%與(17.25±12.18)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)。但第1個(gè)觀察周期有6例患者DFI>25%,第2個(gè)觀察周期則有9例>25%,其中有5例患者第1個(gè)周期<25%,但在第2個(gè)周期>25%,表明DFI值雖然相對(duì)穩(wěn)定,但同一個(gè)體內(nèi)亦有波動(dòng)。精子DFI個(gè)體內(nèi)波動(dòng)主要是時(shí)間差異性,可能由于精子在睪丸內(nèi)大概為64d成熟期,在附睪還有大概2周成熟期,所以單次SCSA結(jié)果只代表取樣時(shí)而不代表取精以前和之后精子染色質(zhì)質(zhì)量。另外,環(huán)境、高熱、藥物、精神和身體應(yīng)激狀態(tài)都能影響精子染色質(zhì)質(zhì)量。建議每個(gè)治療周期均需檢測(cè)DFI從而選擇合適的治療方案。精子DFI的檢測(cè)方法有直接和間接測(cè)量的方法,不同的方法測(cè)量的結(jié)果雖然高度相關(guān),但仍有一定差異。目前SCSA是推薦的方法,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和不同實(shí)驗(yàn)室之間測(cè)量的值均較穩(wěn)定,但一定要嚴(yán)格遵守SCSA檢測(cè)程序,做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控。精液參數(shù)與SCSA檢測(cè)的DFI參數(shù)之間關(guān)聯(lián)性的研究結(jié)論并不一致,部分研究認(rèn)為精子參數(shù)(濃度、活力及形態(tài))與DFI之間沒有明顯的相關(guān)性。但多數(shù)作者認(rèn)為兩者之間存在一定程度的相關(guān)性,特別是與前向運(yùn)動(dòng)精子比例的負(fù)相關(guān)性最顯著。2009年Moskovtsev等分析了2568例患者,發(fā)現(xiàn)DFI與精子濃度(r=-0.219)、活動(dòng)力(r=-0.608)呈顯著負(fù)相關(guān)。不同的精子染色質(zhì)損傷檢測(cè)方法(SCD、TUNEL、SCSA)之間結(jié)果高度一致。SCD、TUNEL檢測(cè)結(jié)果與精液參數(shù)之間的相關(guān)性研究亦同樣顯示了矛盾的結(jié)果。本文的結(jié)果顯示,DFI和精子濃度呈輕度負(fù)相關(guān)(r=-0.162),與快速前向運(yùn)動(dòng)精子比例(r=-0.371)、慢速前向運(yùn)動(dòng)精子比例(r=-0.264)和TPMC(r=-0.307)呈中度負(fù)相關(guān)。精子活力對(duì)體內(nèi)精卵自然結(jié)合非常關(guān)鍵,精子活力受損亦部分解釋了DFI異常導(dǎo)致IUI妊娠率低的原因。本研究亦表明,處理前的TPMC與生化妊娠、臨床妊娠均有關(guān)系,隨著TPMC的升高,妊娠率將增加。DFI與精液參數(shù)部分相關(guān),但并不是完全獨(dú)立于精液常規(guī)檢查的指標(biāo)。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)與精液常規(guī)參數(shù)的異?？赡苁蔷影l(fā)生及成熟過程中的某些共因如生精過程中的細(xì)胞凋亡、精子染色質(zhì)包裝異常和精子運(yùn)輸過程中氧自由基的影響等造成。DFI的臨床價(jià)值在于預(yù)測(cè)臨床妊娠率,其價(jià)值的體現(xiàn)依賴于其閾值。DFI的檢測(cè)方法較多,其閾值亦各有不同,而且波動(dòng)范圍較大。既往文獻(xiàn)報(bào)道SCSA方法檢測(cè)的DFI閾值有:20%,27%,30%,40%。Evenson等評(píng)價(jià)男性生育潛能,認(rèn)為DFI在0～15%具有高生育潛能,16%～29%具有中生育潛能,30%以上具有低生育潛能。TUNEL方法檢測(cè)的DFI閾值波動(dòng)于4%～36%。目前SCSA檢測(cè)的DFI閾值為30%得到了相對(duì)廣泛的認(rèn)同,但瑞典南部政府對(duì)于DFI>25%的IUI治療周期即不予醫(yī)療補(bǔ)助,建議轉(zhuǎn)IVF/ICSI治療。Evenson等研究發(fā)現(xiàn)DFI≤30%的男性其妻臨床妊娠率是DFI>30%的6.54倍(95%CI:1.71～24.91)。Spanò等研究發(fā)現(xiàn)DFI≤40%的男性其妻臨床妊娠率是DFI>40%的7.59倍(95%CI:2.54～22.67)。Bungum等研究了387個(gè)IUI周期發(fā)現(xiàn)DFI>30%,其生化妊娠率和臨床妊娠率只有DFI≤30%者的0.10(95%CI:0.02～0.41)和0.10(95%CI:0.02～0.42)倍。本研究觀察了482個(gè)IUI周期,閾值25%的規(guī)定是采用分類與回歸樹分析得出的。單因素Logistic回歸分析表明DFI和妊娠率有相關(guān)性,并發(fā)現(xiàn)DFI>25%,其生化妊娠率和臨床妊娠率只有DFI≤25%者的0.31(95%CI:0.12～0.79)和0.34(95%CI:0.13～0.86)倍。由于精子參數(shù)和DFI相關(guān)性較強(qiáng),進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析表明TPMC和DFI均與妊娠率相關(guān),DFI>25%的患者,其生化妊娠率和臨床妊娠率只有D