第八章-血清酶類測(cè)定

第八章血清酶類測(cè)定第一節(jié)概述血漿特異酶

在血漿中發(fā)揮特定的催化作用的酶稱為血漿特異性酶，亦稱血漿功能性酶。多數(shù)由肝臟合成并以酶原形式分泌入血，在一定條件下被激活起作用。與凝血有關(guān)的酶或酶原：ChE、銅藍(lán)蛋白及脂蛋白脂肪酶等。外分泌酶

由外分泌腺合成并分泌進(jìn)入血漿的酶稱外分泌酶,參與食物的消化過程，正常血液中含量很少。包括P-AMY、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。

細(xì)胞酶

存在于細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝的酶。隨著細(xì)胞的不斷更新或破壞可少量釋入血液。當(dāng)其大量出現(xiàn)于血清中時(shí)，提示酶的來源組織細(xì)胞受損，最常用于臨床診斷。一、血清酶的來源

二、酶活性測(cè)定在臨床診斷中的應(yīng)用

由于酶廣泛分布于全身各器官、組織，所以酶活性的測(cè)定用于消化系統(tǒng)、心血管、骨骼、肌肉、腎等器官和組織的疾病與惡性腫瘤的診斷。（一）在診斷肝膽疾病中的應(yīng)用肝是機(jī)體新陳代謝最活躍的器官，這是由于肝細(xì)胞中含有最豐富的酶類。

肝酶譜：AST、ALT、GGT、ALP、TP、ALB、GLB、

TBILI、DBILI、IBILI、CHE主要是用來判斷有無肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、肝內(nèi)外膽汁淤積等肝膽疾病。ALT被認(rèn)為是肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一。CHE在急性肝炎、肝硬化、農(nóng)藥中毒時(shí)，可降至正常30%~50%。GGT、ALP等酶主要用于膽道疾病特別是膽道梗阻時(shí)的臨床診斷。單胺氧化酶（MAO）是結(jié)締組織中的酶類，其活性測(cè)定可用于肝纖維化程度的判斷。（二）在診斷心肌梗死中的應(yīng)用用于診斷心肌梗死的血清酶主要有AST、LDH、CK、CK-MB和α-HBD。AST廣泛分布于機(jī)體各組織中，但在心肌中含量最多。LDH是低度特異性酶，LDH1在心肌中含量最高，

LDH2酶活性>LDH1

當(dāng)心肌梗死時(shí)，LDH1>>LDH2CK-MB在診斷心肌梗死最佳的血清酶指標(biāo)。當(dāng)心肌梗死時(shí)，CK-MB可增高10~25倍。m-AST（線粒體型天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）與心肌梗死并發(fā)心力衰竭的發(fā)病率和死亡率有正比關(guān)系。（三）在診斷胰腺疾病中的應(yīng)用用于急性胰腺炎的診斷和鑒別診斷的酶有AMY及其同工酶、LPS(脂肪酶)等。均來自胰腺泡的分泌。AMY

在急性胰腺炎時(shí)，顯著升高。注意：伴有高血脂的急性胰腺炎和靜止性胰腺炎時(shí)，AMY

活性正常。LPS在診斷胰腺炎特異性較高，但尿液中檢測(cè)不到LPS。（四）在診斷骨骼疾病中的應(yīng)用ALP

是各種骨骼疾病最重要的酶學(xué)診斷指標(biāo)

當(dāng)發(fā)生骨骼肌疾病時(shí)，特別是成骨肉瘤、畸形骨炎，可分別增至正常的45倍與30倍。（五）在診斷前列腺疾病中的應(yīng)用ACP(堿性磷酸酶)用于診斷前列腺疾病，特別是診斷前列腺癌的最重要指標(biāo)。主要分布于前列腺、紅細(xì)胞、血小板等，成年男子血清中

1/3~1/2的ACP來自于前列腺。（六）在診斷腫瘤中的應(yīng)用具有器官特異性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特異性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及組織癌變過程中，與細(xì)胞正常分化、增殖功能有關(guān)的酶或同工酶活性下降，并出現(xiàn)腫瘤組織中的同工酶升高。血清酶的生理變異

1.性別少數(shù)酶如CK、ALP及GGT等有性別差異，與血清酶的來源組織有關(guān)。2.年齡血清酶的活性隨年齡而變化，ALP和GGT到老年時(shí)可有輕度升高。年齡差異也見于同工酶。3.進(jìn)食過量飲酒可使血清GGT明顯升高。4.運(yùn)動(dòng)多種血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT

等，其升高的幅度與運(yùn)動(dòng)量、持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)頻率及骨骼肌所含的酶量有關(guān)。5.妊娠胎盤組織可分泌一些酶進(jìn)入母體血液，如耐熱ALP、

LD、LAP和ALT（少數(shù)）等，引起血清中這些酶活性升高。6.其他一些酶活性與體重、身高的增長(zhǎng)、體位改變、晝夜變化及家庭因素有關(guān)。酶的區(qū)域化分布血清酶符號(hào)來源丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶肌酸激酶乳酸脫氫酶堿性磷酸酶酸性磷酸酶

-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶5-核苷酸酶單胺氧化酶

-淀粉酶脂肪酶谷氨酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶膽堿酯酶山梨醇脫氫酶鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶ALTASTCKLDHALPACP

-GT5-NTMAOAMSLPSGLDHICDCHESDHOCTLCAT肝、腎、心心、肝、骨骼肌骨骼肌、心、腦心、腎、骨骼肌、肝、肺小腸、胎盤、肝、腎前列腺、紅細(xì)胞、血小板肝、膽、腎、小腸肝、膽道肝、腎、腦胰、唾液腺胰肝肝、胎盤、心肝肝肝肝第二節(jié)臨床常用血清酶活性測(cè)定標(biāo)本（血清或血漿）

臨床酶學(xué)測(cè)定酶之前，標(biāo)本還要經(jīng)過采集、分離和儲(chǔ)存等一系列處理過程。而酶在血中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，血液離開機(jī)體后還會(huì)有一定變化。因此在其中任何一個(gè)階段處理不當(dāng)，都有可能引起測(cè)定值的變化。標(biāo)本應(yīng)避免溶血：大多數(shù)酶在血細(xì)胞中的含量比在血漿中高得多

，少量血細(xì)胞的破壞就可能引起血漿中酶明顯升高。如紅細(xì)胞內(nèi)的LD、AST和ALT活性分別較血清中高150、15和7倍左右，故測(cè)定這些酶時(shí)，樣品應(yīng)避免溶血。及時(shí)分離血清（血漿）：靜脈采血后，必須在1-2h內(nèi)及時(shí)離心，將血清與血細(xì)胞、血凝塊分離，以免血細(xì)胞中的酶通過細(xì)胞膜進(jìn)入血清而引起誤差。盡量用血清標(biāo)本：

大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性，臨床上除非測(cè)定與凝血或纖溶有關(guān)的酶，一般都應(yīng)以血清作為首選測(cè)定標(biāo)本。

及時(shí)測(cè)定，如不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)放入冰箱保存（但有些標(biāo)本不能冷凍）

為防止酶蛋白變性，一般至少應(yīng)在血清分離后的當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定，否則應(yīng)放冰箱冷藏

有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低溫(特別是20℃冰凍)可引起不可逆性失活，反而不如室溫穩(wěn)定（“冷變性”）。氨基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定氨基轉(zhuǎn)移酶又稱轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體內(nèi)多達(dá)60余種，廣泛存在于肝臟、心肌、骨骼肌、腎、腦、胰、肺、白細(xì)胞、紅細(xì)胞中。其中以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT或GPT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST或GOT)兩種最為重要，它們催化機(jī)體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)：

ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸?丙酮酸+L-谷氨酸

ASTL-天門冬氨酸+α-酮戊二酸?草酰乙酸+L-谷氨酸

A-NH2+BA+B-NH2轉(zhuǎn)氨酶[測(cè)定方法]一、賴氏比色法原理丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性測(cè)定試劑與器材1、0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液2、0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液3、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.4）4、底物緩沖液5、1.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液6、0.4mol/L氫氧化鈉溶液7、2mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液8、器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。實(shí)踐步驟加入物（ml）測(cè)定管對(duì)照管

血清0.10.1

底物緩沖液0.5-

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫30min2，4-二硝基苯肼溶液0.50.5底物緩沖液-0.5混勻后，置37℃水浴保溫20min，每管加入0.4mol/LNaOH5.0ml，混勻，室溫放置5min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)505nm處，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。

參考范圍：5~25卡門單位注意事項(xiàng)1.血清ALT在室溫（25℃）可以保存2d，在4℃冰箱可保存2周，在-20℃可保存1個(gè)月。2.嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血血清可增加測(cè)定的吸光度。3.糖尿病酮癥酸中毒病人血中因含有大量酮體，能與2，4-二硝基苯肼溶液作用呈色，引起吸光度增加，因此，此類標(biāo)本應(yīng)做對(duì)照管。方法評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)便，易于普及，能較好反映酶的真實(shí)活性。故衛(wèi)生部臨檢中心建議國(guó)內(nèi)無條件使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法的單位使用賴氏法。2.不適用自動(dòng)分析儀；試劑穩(wěn)定性差,底物緩沖液不易保存(易長(zhǎng)菌);反應(yīng)中丙酮酸生成量與ALT活性不能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，這是賴氏法的最大缺陷。(二)速率法轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定多用比色法，以賴氏法最常用。目前，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室多采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。ALT速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：

ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸L-谷氨酸+L-丙酮酸

LD丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+上述偶聯(lián)反應(yīng)中，NADH的氧化速率與標(biāo)本中酶活性呈正比，可在340nm檢測(cè)吸光度下降速率。根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-△A／min)，計(jì)算出ALT的活性濃度。[參考區(qū)間]速率法：男性：5～40U/L女性：5～35U/L

ALT廣泛分布于全身各組織器官，尤以肝細(xì)胞中含量最多，其次是腎臟、心臟及骨骼肌，通常只有極少量釋放入血液，所以血清中此酶的活力很低，當(dāng)這些組織病變時(shí)，細(xì)胞壞死或通透性增加，細(xì)胞內(nèi)酶大量釋放入血，使血清中該酶活力顯著增高。

[臨床意義](1)肝膽疾?。杭毙圆《拘愿窝?、慢性活動(dòng)型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬變活動(dòng)期、中毒性肝炎、膽結(jié)石、膽管炎和膽囊炎等。(2)心血管疾?。杭毙孕募」Ｋ?、急性心肌炎、急性心力衰竭、腦出血等。(3)骨骼肌疾病：多發(fā)性肌炎、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良等。（4）一些藥物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、異菸肼、苯巴比妥、奎寧、水楊酸制劑及酒精、鉛、汞、四氯化碳或有機(jī)磷等

ALT在肝臟疾病中的應(yīng)用價(jià)值A(chǔ)LT急性明顯升高，常達(dá)200U以上，病情較重者可達(dá)400-600U以上，甚至更高，個(gè)別重型病人甚至可超過1000U。ALT越高，肝臟細(xì)胞損害越嚴(yán)重。慢性活動(dòng)性肝炎：ALT持續(xù)輕度升高幾十或100U以上（100～200U）慢性肝炎急性肝炎重型肝炎由于肝細(xì)胞發(fā)生大量變性，壞死，使ALT大量進(jìn)入血液，因此，ALT迅速升高，高達(dá)數(shù)百～1000U以上，如果ALT含量越高，上升越快，說明肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，病情進(jìn)展也越快。當(dāng)病情發(fā)展到一定的嚴(yán)重程度，肝細(xì)胞大量壞死，肝臟生產(chǎn)ALT的能力喪失，這時(shí)血液中的ALT降低，但是黃疸卻持續(xù)升高（膽紅素上升），這種現(xiàn)象即所謂“酶膽分離”，往往提示病情正在惡化，常是肝壞死征兆。ALT增高程度與肝硬化的活動(dòng)度和肝組織炎癥改變及肝細(xì)胞損害程度相一致。對(duì)ALT進(jìn)行監(jiān)測(cè)有助于對(duì)肝硬化病情的判斷。若是靜止性肝硬化，則ALT維持正常；肝硬化病人的轉(zhuǎn)氨酶出現(xiàn)較大幅度的升高，提示病情可能發(fā)展成活動(dòng)性，須引起警惕。肝硬化肝癌80%—90%肝細(xì)胞都是在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的，因此，在早期，ALT是否增高主要決定于肝硬化的活動(dòng)程度。若是靜止性肝硬化，則ALT維持正常，因?yàn)楦渭?xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，細(xì)胞并沒有壞死破壞，ALT沒有釋放出來，因此，ALT沒有升高，或ALT有輕度或中度增高。血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性測(cè)定[測(cè)定方法]一、速率法（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）NADH在340nm處有特征吸收峰，連續(xù)監(jiān)測(cè)NADH消耗引起的340nm吸光度變化,根據(jù)340nm處吸光度下降速率（－△A/min）計(jì)算AST活性參考方法

ASTL-天門冬氨酸+α-酮戊二酸?草酰乙酸+L-谷氨酸自發(fā)↓脫羧丙酮酸（二）賴氏比色法[參考區(qū)間]賴氏比色法：

8～28卡門單位（反應(yīng)溫度為37℃）速率法：8～40U/L（反應(yīng)溫度為37℃，試劑不含P5P）

[臨床意義]1.AST廣泛分布于全身各組織器官，在心肌細(xì)胞內(nèi)含量最多，當(dāng)心肌梗死時(shí)，血清中AST活力增高，在發(fā)病后6～12h之內(nèi)顯著增高，在48h達(dá)到高峰，約在3～5d恢復(fù)正常。2.血清中的AST也可來源于肝細(xì)胞，各種肝病可引起血清AST的升高，有時(shí)可達(dá)1200卡門單位，中毒性肝炎還可更高。3.肌炎、胸膜炎、腎炎及肺炎等也可引起血清AST的輕度增高。AST/ALT比值大小有助于臨床判斷肝病嚴(yán)重程度急性肝炎的AST/ALT均值為0.56:1肝硬化的AST/ALT均值為1.13：1肝癌組AST/ALT均值為2.41：1急性肝壞死組AST/ALT均值為3.61：1肝細(xì)胞中的總含量：AST（主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)）＞ALT（主要存在于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)）肝細(xì)胞輕度損傷時(shí)主要是胞漿酶釋放出來，血清中ALT＞AST；而肝細(xì)胞重度損傷時(shí)胞漿酶、線粒體酶均釋放出來，血清中AST＞＞ALT；隨著肝病由輕變重，AST/ALT的比值就由＜1變?yōu)椋?第三節(jié)血清r-谷氨?；D(zhuǎn)移酶測(cè)定血清

-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性測(cè)定

GGT是催化

-谷氨酰基移換反應(yīng)的一種酶GGT分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。

GGT在肝臟中廣泛分布于肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管一側(cè)和整個(gè)膽管系統(tǒng)，因此當(dāng)肝內(nèi)合成亢進(jìn)或膽汁排出受阻時(shí)，血清中GGT增高。

以γ-谷氨酰α-萘胺作為γ-谷氨?；墓w，雙甘肽作為受體，在GGT作用下，產(chǎn)生α-萘胺，后者與重氮試劑反應(yīng)，產(chǎn)生紅色α-萘胺-對(duì)-偶氮苯磺酸，其色澤的深淺與GGT活力成正比。一、重氮反應(yīng)比色法原理試劑與器材1.150mmol/L雙甘肽溶液2.1mol/LHCL3.底物緩沖液4.2g/L對(duì)氨基苯磺酸醋酸溶液5.1.0g/L亞硝酸鈉溶液6.顯色劑7.1.5mmol/La-萘胺標(biāo)準(zhǔn)貯存液8.0.15mmol/La-萘胺標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液9.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。實(shí)踐步驟加入物（ml）測(cè)定管對(duì)照管

血清0.05-

底物緩沖液0.50.5

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min顯色劑0.50.5血清-0.05混勻后，置37℃水浴保溫10min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)530nm處，以對(duì)照管調(diào)零，讀取各管吸光度。

參考范圍：成年男性3~17U/L

成年女性2~13U/L[測(cè)定方法]一、速率法以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺為底物，雙甘肽為谷氨?；氖荏w，在GGT的催化下，谷氨?；D(zhuǎn)移到雙甘肽分子上，同時(shí)釋放出黃色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，根據(jù)405nm處吸光度增加的速率（△A/min）推算出GGT活性單位原理參考范圍：成年男性11~50U/L

成年女性7~32U/L注意事項(xiàng)溶血標(biāo)本，>500mg/L以上可使活性減低，黃疸及脂血標(biāo)本不干擾本法測(cè)定結(jié)果。血清中GGT的活性，在室溫或4℃可穩(wěn)定7天，在冷凍狀態(tài)下可穩(wěn)定2個(gè)月。生物化學(xué)特征

γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT或GGT)又稱γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，是一種線粒體酶。組織分布以腎臟含量最多，其次為胰、肺、肝等。

γ-GT是肝膽疾病檢出陽(yáng)性率最高的酶。膽道疾病如膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻時(shí)，γ-GT不僅陽(yáng)性率高，而且升高明顯。

γ-GT還可用于判斷惡性腫瘤有無肝轉(zhuǎn)移，腫瘤患者如有γ-GT的升高，常說明有肝轉(zhuǎn)移。

γ-GT與乙醇的攝取量有關(guān)，飲酒時(shí)，由于乙醇對(duì)肝細(xì)胞線粒體的誘導(dǎo)導(dǎo)致γ-GT活性升高，故對(duì)乙醇性中毒的判定有相當(dāng)?shù)膬r(jià)值。長(zhǎng)期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者常有γ-GT升高。第四節(jié)血清淀粉酶（AMS/AMY）活性測(cè)定人和動(dòng)物只含α-AMY，此酶以Ca2+為必需因子（除肝素外，各種抗凝劑可通過螯合Ca2+

抑制AMS活性，故標(biāo)本必須用血清或肝素抗凝血漿）.血清中的AMS主要有胰型(P型)和唾液型(S型)及其亞型同工酶組成人體中胰腺含AMY最多，唾液腺也分泌大量AMY。

AMY分子量較小，易由腎臟排出，半壽期很短（約2h），所以病變時(shí)血清AMY增高持續(xù)時(shí)間很短。[測(cè)定方法]天然淀粉底物方法：（分子組成）確定底物方法：碘-淀粉比色法

目前應(yīng)用最多的方法是以人工合成的麥芽多糖為底物的方法二、碘-淀粉比色法原理α-淀粉酶淀粉葡萄糖+麥芽糖+糊精+碘液蘭色復(fù)合物血清(尿)中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4-糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及含有α-1，6-糖苷鍵支鏈的糊精。在底物充分（已知濃度）的條件下，反應(yīng)后加入碘液與未被水解的淀粉結(jié)合，生成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管(此處亦相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管)比較，從而推算出AMS的活力單位。試劑與器材1.0.4g/L緩沖淀粉溶液2.0.1mol/L碘貯存液3.0.01mol/L碘應(yīng)用液4.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時(shí)鐘、分光光度計(jì)。實(shí)踐步驟先用生理鹽水將血清作10倍稀釋（尿液20倍稀釋）加入物（ml）測(cè)定管對(duì)照管緩沖淀粉溶液(37℃預(yù)溫5min)1.01.0

稀釋血清(稀釋尿液）0.2-

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫7.5min碘應(yīng)用液1.01.0蒸餾水6.06.2混勻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)660nm處，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。

成本低、檢測(cè)不需要昂貴儀器、試劑穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便；但重復(fù)性差、準(zhǔn)確率低方法評(píng)價(jià)：[參考區(qū)間]碘-淀粉比色法：[臨床意義]血清(尿)AMS活性是診斷胰腺疾病的重要指標(biāo)。

升高

——急性胰腺炎、流行性腮腺炎；

——急性膽囊炎、腸梗阻、胰腺癌、膽石癥、潰瘍病穿孔及嗎啡注射后。降低

——肝炎、肝硬化、肝癌；

——腎功能障礙。急性胰腺炎時(shí)血、尿淀粉酶升高的不同表現(xiàn)開始升高時(shí)間高峰時(shí)間恢復(fù)時(shí)間血清8-12h12-24h2-5d尿液12-24h5-7d1-2w第五節(jié)血清堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定

ALP廣泛分布定位于細(xì)胞膜表面，其含量依次為肝、腎、胎盤、小腸、骨骼等。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼，主要用于診斷肝膽和骨骼疾病一、比色法原理在pHl0的堿性條件下，ALP催化磷酸苯二鈉底物水解，生成游離的酚和磷酸氫二鈉。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林結(jié)合，并經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌類衍生物，根據(jù)紅色深淺計(jì)算出ALP活力的大小。試劑與器材1.0.1mol/L碳酸鹽緩沖液2.20mmol/L磷酸苯二鈉溶液3.鐵氰化鉀溶液4.酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液5.酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液6.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時(shí)鐘、分光光度計(jì)。實(shí)踐步驟加入物（ml）測(cè)定管對(duì)照管

血清0.1-

碳酸鹽緩沖液1.01.0

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫5min底物液（預(yù)溫至37℃）1.01.0混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min鐵氰化鉀溶液顯色劑3.03.0血清-0.1混勻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510nm處，讀取各管吸光度。

1.

血清標(biāo)本應(yīng)新鮮，置室溫(25℃)6h測(cè)定，ALP活性約增高1

％；置室溫1～4d，ALP活性增高3％～6％；若冰凍保存，血清復(fù)溶后ALP活性升高可達(dá)30％。2．一般用血清與肝素抗凝血漿測(cè)定ALP活性?？鼓齽┤鏓DTA-

Na2、草酸鹽、檸檬酸鹽等因能絡(luò)合Mg2+而抑制ALP活性，故不能使用這類抗凝劑的血漿做于ALP活性測(cè)定。3．ALP測(cè)定受年齡與性別、飲食、運(yùn)動(dòng)和妊娠等因素的影響。

注意事項(xiàng)[測(cè)定方法]二、速率法原理以對(duì)-硝基苯酚磷酸鈉（PNPP）為底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇AMP或二乙醇胺（DEA）為磷酸?；氖荏w。在堿性條件下，ALP催化PNPP水解釋放出磷酸基團(tuán)，生成游離對(duì)-硝基酚（PNP），PNP在堿性溶液中轉(zhuǎn)變成醌式結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)較深的黃色。根據(jù)405nm處吸光度增加的速率（△A/min）推算出血清ALP活性單位。[參考區(qū)間]金氏比色法：成人：3～13金氏單位，兒童：5～28金氏單位速率法：女性：1～12歲<500U/L

>15歲40～150U/L

男性：1～12歲<500U/L12～15歲<750U/L>25歲40～150U/L。

ALP檢測(cè)主要用于診斷肝膽和骨骼疾病[臨床意義](1)肝膽系統(tǒng)疾?。焊鞣N肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾?。篈LP明顯升高，且ALP升高與血清膽紅素升高相平行，肝內(nèi)局限性膽道阻塞（如肝癌、肝膿腫）：ALP明顯增高，血清膽紅素大多正常。

累及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的肝膽疾?。ǜ窝?、肝硬化）：ALP輕度升高。(2)骨骼疾?。海?）妊娠后期及兒童生長(zhǎng)期ALP生理性增高由于骨的損傷或疾病使成骨細(xì)胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放入血液中，引起血清ALP活力的增高。如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。第六節(jié)LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以骨骼肌.肝、心肌、腎含量較多。其次是脾.胰及肺組織中.組織中LDH活力約比血清高1000倍，紅細(xì)胞內(nèi)LDH活力較血清約高100倍（溶血可引起LDH明顯升高）。LDH有5種同工酶。血清乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定乳酸脫氫酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙酮酸，同時(shí)將氫轉(zhuǎn)移給輔酶NAD+而成為NADH。

L-乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+

(氧化型輔酶1)(還原型輔酶1)pH8.8～9.8pH7.4～7.8乳酸脫氫酶在有輔酶I(NAD+)存在的情況下，催化乳酸脫氫生成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色。其顏色深淺與丙酮酸濃度成正比，同樣處理丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，即可求得LDH的活力單位。反應(yīng)式如下：一、比色法原理

LDH乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+丙酮酸+2，4-二硝基苯肼丙酮酸-二硝基苯腙

+H2ONaOH試劑與器材1.底物緩沖液2.11.3mmol/LNAD+

溶液3.1mmol/L

2，4-二硝基苯肼4.0.4mol/LNaOH5.0.5mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液6.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。實(shí)踐步驟加入物（ml）測(cè)定管對(duì)照管

血清0.01

0.01

底物緩沖液0.5

0.5

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫5minNAD+

溶液0.1

-混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min2，4-二硝基苯肼0.5

0.5NAD+

溶液

-0.1混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15minNaOH溶液5.05.0混勻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)440nm處，用蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。

二、乳酸為底物的速率法（LD-L法）原理[參考區(qū)間]速率法：

109～245U／L比色法：190～437金氏單位注意事項(xiàng)1.用血清或肝素抗凝血漿測(cè)定LDH活性的效果令人滿意，草酸鹽抗凝劑對(duì)LDH活性有抑制作用。標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格避免溶血。2.LDH4、LDH5對(duì)冷特別不穩(wěn)定(冷變性)，其活性在-20℃過夜就喪失，故標(biāo)本不宜冰箱存放。血清標(biāo)本室溫存放可穩(wěn)定2~3d。[臨床意義]LDH測(cè)定常用于心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤的輔助診斷。LDH與CK-MB、AST聯(lián)合可判定心肌梗死的病程。正常情況下，新生兒LDH含量較高，約為成人2倍，隨著年齡增長(zhǎng)逐漸降低，至14歲時(shí)趨于穩(wěn)定。LDH是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶。按電泳速度命名。臨床意義心肌，腎和紅細(xì)胞中以LDH1和LDH2最多骨骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺，脾，胰，甲狀腺，腎上腺和淋巴結(jié)等組織中以LDH3最多LDH活力增高主要見于以下疾?。?．心血管疾病

LDH由于分子量較大，在常用心肌酶中升高最遲心肌梗死患者在發(fā)生胸痛后8～12hLDH開始升高

24～48h達(dá)高峰升高水平通常為正常的3～4倍，最高可達(dá)10倍。LDH中度升高見于心肌炎，伴有肝淤血的心衰，重度休克及缺氧。2．肝病伴有黃疸的中毒性肝炎患者，LDH可達(dá)正常10倍。LDH升高亦可見于病毒性肝炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥、肝硬化等。3．惡性腫瘤

70％有肝轉(zhuǎn)移的腫瘤患者及20％～60％無肝轉(zhuǎn)移的腫瘤患者有LDH水平升高。霍奇金病、腹部及肺部腫瘤、胚胎細(xì)胞腫瘤、白血病等亦有LDH升高。4．其它疾病溶血性疾病、腎病、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、肺栓塞亦伴有LDH

升高。第七節(jié)血清肌酸激酶測(cè)定CK廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。肝.紅細(xì)胞含有微量或不含CK，輕度溶血不影響結(jié)果。

血清肌酸激酶（CK）活性測(cè)定肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，反應(yīng)平衡點(diǎn)與體系pH有關(guān)。

pH9.0Cr+ATPCrP+ADP

pH6.7(肌酸)(磷酸肌酸)[測(cè)定方法]測(cè)定方法有比色法（如肌酸顯色法）、速率法(酶偶聯(lián)法)和熒光分析法。其中以速率法最常用，有兩種工具酶及指示酶參與反應(yīng)。IFCC測(cè)定CK的參考方法為速率法(酶偶聯(lián)法)

。

血清肌酸激酶（CK）活性測(cè)定在肌酸激酶的催化下，磷酸肌酸與ADP反應(yīng)生成肌酸和ATP，肌酸與雙乙酰、α-萘酚結(jié)合生成紅色化合物。這種紅色化合物在一定范圍內(nèi)與肌酸量呈線性關(guān)系，在540nm波長(zhǎng)處與同法處理的肌酸標(biāo)準(zhǔn)液比色，求得血清CK的活性。

pH6.7CrP+ADP

Cr+ATP

(磷酸肌酸)

(肌酸)【試劑與儀器】

1．Tris-HCl緩沖液(pH7．4)2．12mmol／L磷酸肌酸溶液3．4mmol／LADP溶液4．混合底物溶液5.50g／L硫酸鋅溶液6.60/L氫氧化鋇溶液7．貯存堿液8．α-萘酚溶液9．雙乙酰溶液10．1.7mmol／L肌酸標(biāo)準(zhǔn)液11.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時(shí)鐘、分光光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)步驟加入物(m1)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管血清一一0.1

肌酸標(biāo)準(zhǔn)液一0．1一蒸餾水0．1一一混合底物液0．750．750．75

混勻，37℃水浴30分鐘氫氧化鋇溶液0．50．50．5

硫酸鋅溶液0．50．50．5

蒸餾水0．50．50．5

充分振蕩，混勻后離心(2000r／min)10分鐘，取上清液上述上清液0．50．50．5a一萘酚溶液1．01．01．0

雙乙酰溶液0．50．50．5

混勻，37℃水浴15~20分鐘蒸餾水2．52．52．5

混勻，在540nm波長(zhǎng)處，以空白管調(diào)零，分別測(cè)定吸光度值。

參考范圍8~60U/L二、速率法(酶偶聯(lián)法)可在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定NADPH生成速率而計(jì)算CK活性濃度。[臨床意義]骨骼肌中CK含量較高，在各種類型的進(jìn)行性肌萎縮時(shí)CK活性均可增高。臨床上主要用于診斷心肌梗死。急性心肌梗死后3～6h就開始急劇升高

20～30h達(dá)高峰可高達(dá)正常上限的10～12倍

CK對(duì)診斷心肌梗死較AST、LDH的特異性高但此酶增高持續(xù)時(shí)間短，在2～4d后就恢復(fù)正常病毒性心肌炎時(shí)，CK活力也明顯升高，對(duì)診斷及判斷預(yù)后有參考價(jià)值。CK總酶與CK同工酶聯(lián)合測(cè)定可判定CK的來源。CK、AST、LDH聯(lián)合測(cè)定有助于判定心肌梗死的病程。第八節(jié)臨床上常進(jìn)行的同工酶測(cè)定有LDH、CK、AST、GGT、AMS等。LDH同工酶主要用于心肌梗死、肝病、惡性腫瘤和貧血的診斷。CK同工酶用于心肌梗死早期診斷、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病。AST同工酶用來判斷細(xì)胞損傷程度ALP同工酶用于診斷肝膽系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤GGT同工酶用于診斷原發(fā)性及繼發(fā)性肝癌AMS同工酶有助于提高急性胰腺炎診斷的敏感性和特異性測(cè)定。同工酶測(cè)定的常用方法主要有電泳法、層析法、動(dòng)力學(xué)法、免疫化學(xué)法等。本章主要介紹心肌酶譜中的LDH、CK、AST三種同工酶測(cè)定。LDH是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶。按電泳速度命名。血清乳酸脫氫酶同工酶測(cè)定心肌，腎和紅細(xì)胞中以LDH1和LDH2最多骨骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺，脾，胰，甲狀腺，腎上腺和淋巴結(jié)等組織中以LDH3最多[測(cè)定方法]測(cè)定LDH同工酶的方法主要有5類：①電泳法；②離子交換柱層析法；③免疫學(xué)法；④抑制劑法；⑤酶水解法等。其中電泳法為應(yīng)用最早且目前應(yīng)用最廣泛的方法，在電泳法中有瓊脂糖電泳法、乙酸纖維素膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳和全自動(dòng)電泳（也是一種瓊脂糖電泳）等。+LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5正常人體組織中LDH同工酶的組成及相對(duì)含量同工酶及亞基組成心肌肝骨骼肌紅細(xì)胞

LDH1(H4)602442LDH2(H3M)336744LDH3(H2M2)7151710LDH4(HM3)<113164LDH5(M4)<16456<1參考范圍瓊脂糖電泳法：

LDH1（28.4±5.3）%；

LDH2（41.0±5.0）%；

LDH3（19.0±4.0）%；

LDH4（6.6±3.5）%；

LDH5（4.6±3.0）%。

醋酸纖維素薄膜法：

LDH1（25.32±2.62）%

LDH2（34.36±1.57）%

LDH3（21.86±1.38）%

LDH4（11.3±1.84）%

LDH5（7.97±1.59）%臨床上測(cè)定LD同工酶有助于相應(yīng)組織病變的診斷。[臨床意義][參考區(qū)間]健康成年人血清中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LDl>LD3>LD4>LD5部分正常兒童血中可見LDl>LD2。心肌梗死和心肌炎：以LD1和LD2升高為主，即所謂“反轉(zhuǎn)比率”現(xiàn)象，且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，故為診斷AMI的一個(gè)特異指標(biāo)。骨骼肌和肝細(xì)胞損傷：LDH5增高且LDH5＞LDH4，是診斷肝細(xì)胞壞死的敏感指標(biāo)。其它：肺、胰、脾、淋巴結(jié)壞死和炎癥及各種惡性疾病時(shí)LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病時(shí)LD1和LD2升高，但仍為L(zhǎng)D2>LD1；惡性腫瘤如轉(zhuǎn)移到肝臟往往伴有LD4、LD5升高。血清肌酸激酶同工酶測(cè)定在細(xì)胞質(zhì)有三種同工酶：

CK-BB（CK-1）腦型同工酶腦、前列腺、腸、肺、膀胱、子宮、胎盤及甲狀腺占優(yōu)勢(shì)，正常血清CK-BB含量極少，用一般方法測(cè)不出。

CK-MB（CK-2）心型同工酶主要分布于心肌中，正常血清含有少量的CK-MB，不超過總活性的5%。

CK-MM（CK-3）肌型同工酶（氧化型\中間型\還原型）（CK-MB1\CK-MB2）（CK-MM1\CK-MM2\CK-MM3）骨骼肌及心肌占優(yōu)勢(shì)，正常血清絕大部分為CK-MM的活性肌酸激酶（CK）分子是由M亞基和B亞基組成的二聚體。在細(xì)胞線粒體內(nèi)的另一種同工酶：CK-Mt（CK-4）CK-Mt存在于細(xì)胞的線粒體膜上，在正常血清中CK-Mt是不出現(xiàn)的。當(dāng)線粒體崩解時(shí)，線粒體膜的小碎片進(jìn)入血液，故CK-Mt成低聚狀態(tài)。CK同工酶亞型（CK-MM亞型和CK-MB亞型）多用瓊脂糖凝膠高壓電泳、離子交換層析法、免疫抑制法和放射免疫法。[測(cè)定方法]免疫抑制法測(cè)定CK-MB亞型原理：用羊抗CK-M抗體與病人血清共同溫育，血清中的CK-M亞基全部被抑制，測(cè)定剩余的非CK-M活性，即代表CK-BB和CK-MB中的B亞基及CK-Mt活性。由于健康人和心臟、肌肉疾患病人血清中CK-BB和CK-Mt量極低，故一般忽略不計(jì)，這些樣品中的非CK-M活性實(shí)際上代表CK-MB中的B亞基活性，乘以2即為CK-MB活性。[臨床意義]不同組織受損、壞死，血清中就有不同的CK同工酶增高

血清中CK-MB升高是公認(rèn)的診斷AMI和確定有無心肌壞死的重要指標(biāo)此同工酶對(duì)心肌梗死的特異性可高達(dá)100％。CK-MB的特異性超過了AST、LDH、CK，甚至超過LDH1。急性心肌梗死發(fā)病2～4h后，血清CK-MB即開始上升

12～24h達(dá)到峰值如無并發(fā)癥3d后恢復(fù)至正常水平。若下降后的CK-MB再度上升，提示有心肌梗死復(fù)發(fā)。

CK亞型測(cè)定在早期診斷AMI的價(jià)值CK-MM1>CK-MM2>CK-MM3，CK-MB1>CK-MB2。

正常血清中各亞型的含量：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶測(cè)定血清中AST的活性為胞漿型AST（c-AST）和線粒體型AST（m-AST）之和。本實(shí)驗(yàn)采用免疫抑制動(dòng)力學(xué)法測(cè)定m-AST的活性，在羊抗人的c-AST抗體存在條件下，血清中的c-AST活性被抑制，而m-AST的活性不受影響。血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）同工酶測(cè)定[測(cè)定方法]速率法（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）NADH在340nm處有特征吸收峰，連續(xù)監(jiān)測(cè)NADH消耗引起的340nm吸光度變化,根據(jù)340nm處吸光度下降速率（－△A/min）計(jì)算AST活性參考方法注意事項(xiàng)1.使用血清或血漿，應(yīng)避免溶血。2.m-AST在室溫中穩(wěn)定性差，采血后應(yīng)盡快測(cè)定。臨床意義1.判斷肝損害程度2.協(xié)助慢性肝炎肝病的鑒別3.協(xié)助鑒別惡性膽道梗阻、膽囊炎與膽石癥4.判定心肌梗死的嚴(yán)重程度并推測(cè)預(yù)后

m-AST一般在心肌梗死發(fā)生后12h明顯