色譜分離測(cè)定藥物對(duì)映體的研究進(jìn)展

色譜分離測(cè)定藥物對(duì)映體的研究進(jìn)展

手性藥物對(duì)藥物有重要影響。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)天然藥物和半合成藥物都有手稿，其中98%以上是光學(xué)活性物質(zhì)。40%是合成藥物，700多種藥物中至少有一個(gè)中心，其中90%是外物。手性是生物體系的一個(gè)基本特征,很多內(nèi)源性大分子物質(zhì),如酶、載體、受體、血漿蛋白和多糖等都具有手性特征。手性對(duì)映體藥物通過(guò)與體內(nèi)大分子的不同立體結(jié)合,可產(chǎn)生不同的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程,從而導(dǎo)致藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化。由于手性藥物的兩個(gè)對(duì)映體的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程不同,而可能具有不同的藥理作用,甚至藥效拮抗,也可能一個(gè)對(duì)映體是消旋體藥物不良反應(yīng)的根源。因此手性藥物的分離測(cè)定,對(duì)研究手性藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程,確定藥動(dòng)學(xué)參數(shù),藥理和毒理作用機(jī)制,以及手性藥物質(zhì)量控制等都具有重要意義。利用氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、超臨界色譜和毛細(xì)管電泳分離藥物對(duì)映體,成為新藥研究和分析化學(xué)的領(lǐng)域之一。色譜分離藥物對(duì)映體分為間接法和直接法。前者又稱(chēng)手性試劑衍生化法(CDF),后者可分手性流動(dòng)相添加劑法(CMPA)和手性固定相法(CSP)。無(wú)論哪一種方法,都是以現(xiàn)代色譜分離技術(shù)為基礎(chǔ),引入不對(duì)稱(chēng)中心(或光活性分子)。不同的是CDF法是將其引入分子內(nèi),而CMPA和CSP則引入分子間。引入手性環(huán)境使藥物對(duì)映體間呈現(xiàn)理化特性的差異是色譜拆分的基礎(chǔ)。本文綜述了近年來(lái)利用色譜分離測(cè)定藥物對(duì)映體研究的新進(jìn)展。1間接法間接法是藥物對(duì)映體在分離前,先與高光學(xué)純度衍生化試劑(CDA)反應(yīng)形成非對(duì)映體,再進(jìn)行色譜分離測(cè)定。1.1試劑、手性藥物和反應(yīng)產(chǎn)物的消旋化反應(yīng)手性試劑及反應(yīng)產(chǎn)物在化學(xué)上和手性上都很穩(wěn)定,其光學(xué)性在貯存中不發(fā)生改變;在衍生化反應(yīng)和色譜條件下,試劑、手性藥物和反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)生消旋化反應(yīng);衍生化反應(yīng)生成的非對(duì)映體在色譜分離時(shí)應(yīng)能顯示高柱效;手性試劑應(yīng)具有UV或熒光等敏感結(jié)構(gòu),能使生成物具有良好的可檢測(cè)性;手性化合物對(duì)映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)中應(yīng)具有易于衍生化基團(tuán),如氨基、羰基、羧基和巰基等。1.2手性試劑的選擇非對(duì)映體在色譜系統(tǒng)中的差速遷移與下列因素有關(guān),非對(duì)映體分子的手性結(jié)構(gòu)、手性中心所連接的基團(tuán)和色譜系統(tǒng)的分離效率(包括溶質(zhì)分子與固定相和流動(dòng)相之間的結(jié)合力,如氫鍵、偶極-偶極、電荷轉(zhuǎn)移和疏水性等)。非對(duì)映體衍生物良好的分離度,以及衍生化反應(yīng)的較高的選擇性,都取決于手性試劑的選擇、反應(yīng)產(chǎn)物手性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和生成的化學(xué)鍵類(lèi)型。反應(yīng)產(chǎn)物的構(gòu)型差異越大,分離越容易。1.3hplc-ms聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)衍生物的應(yīng)用對(duì)映體的可檢測(cè)性隨著手性反應(yīng)所生成的衍生物不同而發(fā)生改變,常用UV、熒光和電化學(xué)檢測(cè),隨著HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,已有用MS檢測(cè)的報(bào)道。1.4手性試劑的類(lèi)型和應(yīng)用1.4.1在非對(duì)映射體分離該類(lèi)手性試劑容易與多數(shù)醇類(lèi)及胺類(lèi)手性化合物反應(yīng),生成非對(duì)映體而被分離。被廣泛應(yīng)用于氨基酸及其衍生物、兒茶酚胺類(lèi)、苯丙胺類(lèi)、麻黃素類(lèi)、醇類(lèi)、腎上腺素類(lèi)、腎上腺素拮抗劑及環(huán)氧化合物等的分離,其反應(yīng)迅速,具有立體選擇性,反應(yīng)條件溫和,生成的硫脲非對(duì)映體可以直接用反相和正相色譜分離。1.4.2對(duì)氨基酸的分離其化學(xué)性質(zhì)分屬于酸、醛、胺、酯或酰氯等,但都有特征結(jié)構(gòu)-萘基。α-萘乙酸的甲氧基衍生物用于20多種氨基酸的分離,萘氮甲酸酯可用于伯胺、仲胺和叔胺的分離;萘甲酰氯、萘丙酰氯用于苯丙胺的原料、緩釋劑、糖劑等多種劑型的手性對(duì)映體的分析測(cè)定。1.4.3映射體衍生化的方式該類(lèi)手性衍生化試劑多用于胺、氨基酸及醇類(lèi)藥物的拆分,其非對(duì)映體衍生化通常有兩種情況:一是直接與樣品縮合,生成酰胺或酯后,以反相或正相色譜分離;二是將樣品先與酰氯或磺酰氯反應(yīng),然后引入其它基團(tuán)(多為芳基),合成更有利于拆分與檢測(cè)的非對(duì)映體。1.4.4氨基酸衍生物試劑光學(xué)純度氨基酸及其衍生物是最早采用的色譜手性試劑,先在GC法中應(yīng)用,80年代迅速應(yīng)用于HPLC法。廣泛用于胺、羧酸及醇類(lèi)藥物的拆分,尤以氨基酸為最佳。其衍生化法多基于肽合成原理,此類(lèi)試劑以L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸及其衍生物為多,為了改善檢測(cè)靈敏度常引入芳基;為了提高反應(yīng)活性和定量的回收率,常將羧基轉(zhuǎn)化成?；⑺狒?。1.4.5利用代酒石酸酐類(lèi)羧酸可用冠醚催化與L-2-溴辛烷酯化的方法,O,O-二取代酒石酸酐類(lèi)用于15種重要心血管類(lèi)藥物的拆分。鄰苯二醛在手性硫醇存在下,可將胺類(lèi)衍生化成異吲哚類(lèi),這類(lèi)化合物通常具有強(qiáng)烈熒光和良好的分離度,廣泛用于拆分氨基酸、胺和硫醇。1.5衍生化試劑的選擇分離時(shí)可用價(jià)廉、柱效高的非手性柱;反應(yīng)時(shí)可選擇衍生化試劑提高檢測(cè)靈敏度。缺點(diǎn)是衍生化反應(yīng)使分離時(shí)間延長(zhǎng),操作較復(fù)雜;對(duì)衍生化試劑的要求較高;要求對(duì)映體的衍生化反應(yīng)迅速且反應(yīng)速率一致。2直接法直接法是引入“手性識(shí)別”或“手性環(huán)境”(手性固定相、手性流動(dòng)相添加劑)至色譜系統(tǒng)中,以形成暫時(shí)非對(duì)映體復(fù)合物,從而使藥物對(duì)映體分離。2.1手性流動(dòng)相原料cmpaCMPA按其分離原理和添加劑類(lèi)型分為八種。2.1.1對(duì)映射體的理化性質(zhì)和功能經(jīng)常采用的添加劑是手性環(huán)糊精和手性冠醚。環(huán)糊精分子為錐形筒體,筒腔內(nèi)部呈相對(duì)疏水,可與客體的極性部分形成氫鍵締合。而冠醚則與之相反,腔內(nèi)親水性較高,腔外為疏水性。因此,對(duì)疏水性和親水性藥物對(duì)映體都具有很強(qiáng)的包合作用,并使包合物理化性質(zhì)發(fā)生改變。對(duì)映體分子進(jìn)入手性空腔后即發(fā)生主-客反應(yīng)而被拆分。該法已用于氨基酸及其衍生物(巴比妥類(lèi)、氯胺酮、苯妥英代謝物、叔丁喘寧、美芬妥因及其代謝物、哌嗪類(lèi)鎮(zhèn)痛藥、甲基炔諾酮、偽麻黃堿、17-酮甾體和去甲基安定等)。采用的固定相常為ODS、CN、C3、苯基鍵合相硅膠或硅膠等。檢測(cè)手段多用HPLC-UV和GC-ECD。2.1.2手性配合試劑分離手性金屬配合劑加入色譜流動(dòng)相中,形成三元非對(duì)映體配位化合物,由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和能量的差異,并與固定相發(fā)生立體選擇性吸附和排斥反應(yīng),使兩對(duì)映體得以分離。手性配合試劑多為氨基酸及衍生物(如L-脯氨酸、L-苯丙氨酸等),配位金屬有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+等。該法用于分離氧氟沙星、氨基酸及衍生物、苯妥英類(lèi)代謝物、多巴胺、氨基醇等;此外酒石酸及其衍生物也用于分離氨基酸、去甲腎上腺素、蘋(píng)果酸等,采用反相柱,UV檢測(cè)。2.1.3兩種非對(duì)應(yīng)體的分離穩(wěn)定性在低極性的有機(jī)流動(dòng)相中,對(duì)映體分子與手性離子對(duì)試劑之間產(chǎn)生靜電、氫鍵或疏水性反應(yīng)生成非對(duì)映體離子對(duì)。兩種非對(duì)應(yīng)體離子對(duì)具有不同穩(wěn)定性,并且在有機(jī)相與吸附固定相間的分配行為也有差異,因此得以分離。常用的手性反離子有奎寧、奎尼丁、10-樟腦磺酸、N-苯甲酰氧基羰基-甘氨酸-L-脯氨酸。被分離的藥物有β-阻滯劑、奎寧、奎尼丁、羧酸、磺酸、甲氟嗪、苯丙酰苯心安等。使用的固定相有硅膠、CN、Diol等。2.1.4色譜條件分離甲基化環(huán)糊精和2R,3R-雙正丁基酒石酸等,少量能強(qiáng)烈吸附于固定相表面上,使固定相表面手性化,形成的動(dòng)態(tài)手性固定相在洗脫過(guò)程中與溶質(zhì)相互作用,對(duì)映體按與覆蓋于固定相表面的添加劑之間的作用力強(qiáng)弱而被分離。還有將表面活性劑,如膽酸鹽加入到流動(dòng)相中,色譜過(guò)程中形成由非膠束膽酸鹽溶劑化ODS和膽酸鹽膠束吸附于ODS組成的非均態(tài)手性固定相。主要通過(guò)分配機(jī)制分離對(duì)映體。該系統(tǒng)用于拆分巴比妥、導(dǎo)眠酮、β-阻滯劑、麻黃堿、去甲麻黃堿、S-阿托品、后馬托品、扁桃酸等。2.1.5糖鍵功能團(tuán)的分離藥物對(duì)映體基于分子間的弱作用力氫鍵而被分離,并需使用低極性的流動(dòng)相,在手性添加劑分子中若含有兩個(gè)以上的可以形成氫鍵的功能團(tuán),則可用于分離與之結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的藥物對(duì)映體,如含有兩個(gè)氫鍵功能團(tuán)的氨基酸及其生物、氨基醇等。2.1.6蛋白質(zhì)-溶劑混合物分離藥物對(duì)映射體蛋白質(zhì)(BSA、α-糖蛋白)作手性添加劑,可通過(guò)疏水性、靜電、氫鍵和電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng),形成蛋白質(zhì)-溶質(zhì)復(fù)合物分離藥物對(duì)映體。常用的固定相是經(jīng)修飾的中等粒度的硅膠,已用于分離氨基酸、羧酸、疏水性胺類(lèi)等。2.1.7-氨基戊烷非手性誘導(dǎo)劑利用誘導(dǎo)吸附原理,將手性誘導(dǎo)劑加入到流動(dòng)相中,與對(duì)映體分子共同競(jìng)爭(zhēng)地吸附到非手性固定相表面,發(fā)生立體反應(yīng)形成不穩(wěn)定的非對(duì)映體復(fù)合物,手性誘導(dǎo)劑作為置換劑將對(duì)映體區(qū)分性地?cái)D出柱子,如(-)-α-甲芐胺作為手性誘導(dǎo)劑在硅膠柱上拆分2-氨基庚烷。2.1.8特征性操作簡(jiǎn)便,分析過(guò)程中較少發(fā)生消旋化,添加劑選擇的范圍較寬,純對(duì)映體易從柱后洗脫中回收。缺點(diǎn)是系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng),添加劑消耗較大。2.2手性固結(jié)相法csp手性固定相是由擔(dān)體鍵合高光學(xué)純度的手性異構(gòu)體制作而成。2.2.1pirkle型cps該固定相通過(guò)含末端羧基或異氰酸酯基手性前體與氨基鍵合硅膠進(jìn)行縮合反應(yīng),分別形成含酰胺或脲型結(jié)構(gòu)CSP。第一代Pirkle是將2,2,2-三氟(1-9-蒽)乙醇(TFAE)鍵合到硅膠上形成的固定相,其后Pirkle又制備了一系列3,5-二硝基苯甲酰(DNB)氨基酸、醇、胺衍生物CSP,構(gòu)成第二代Pirkle型CPS;第三代Pirkle型CSP有富電子的萘基和較長(zhǎng)的鍵合烷基鏈,提高了立體識(shí)別能力和通用范圍,此后,又合成了既含π-酸(CDB),又含π-堿(萘基),含有碳、磷、聯(lián)萘等不對(duì)稱(chēng)中心的CSP。近年又相繼合成了氨基磷酸酯及一系列含萘、雜環(huán)的氨基酸衍生物、二氨和由聯(lián)萘、羧酸衍生物的多種CSP,已廣泛用于氨基酸、乙內(nèi)酰脲、內(nèi)酰脲、胺類(lèi)、醇類(lèi)及硫醇類(lèi)藥物對(duì)映體拆分。Pirkle柱大多使用正相分離系統(tǒng),流動(dòng)相常用己烷加少量醇類(lèi)改性劑。最近Rustum發(fā)現(xiàn)也可以用反相分離系統(tǒng),從而擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。2.2.2酸性蛋白手性柱蛋白質(zhì)是一類(lèi)由手性亞基團(tuán)(L-氨基酸)組成的高分子聚合物,可識(shí)別藥物對(duì)映體在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)而達(dá)到手性分離。商品化的手性蛋白質(zhì)鍵合相有兩種:一是將牛血清白蛋白(BSA)共價(jià)鍵合到硅膠上,用于氨基酸及其衍生物對(duì)映體的分離;二是通過(guò)離子鍵(或共價(jià)鍵)以及蛋白交聯(lián)作用將α-酸性蛋白質(zhì)固定于硅膠上,該類(lèi)柱穩(wěn)定性好,柱效高。對(duì)許多藥物對(duì)映體有良好的立體選擇性,可直接分離許多藥物。如硫噴妥因、心得怡及β-阻滯劑等。第三代酸性蛋白手性柱Ovmucoid,是將雞蛋中分離出來(lái)的卵粘蛋白鍵合在硅膠上,該類(lèi)型CSP在很寬的pH范圍內(nèi)有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性,能分離許多胺類(lèi)和羧酸類(lèi)手性藥物,如氯酚寧胺、苯異丙酸類(lèi)等。使用蛋白質(zhì)手性固定相時(shí),一般用磷酸或硼酸緩沖液加0%~5%的乙腈、乙醇、丙酮或醚類(lèi)有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。2.2.3環(huán)糊精鍵合固定相的應(yīng)用環(huán)糊精的手性識(shí)別主要來(lái)自環(huán)內(nèi)腔對(duì)芳烴或脂肪烴類(lèi)側(cè)鏈的包容作用,以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對(duì)映體分子發(fā)生氫鍵作用。β-環(huán)糊精手性鍵合固定相對(duì)形成包合物有最佳大小的內(nèi)腔,適用于大多數(shù)藥物對(duì)映體的位阻和電子特征,因此,廣為使用;α-環(huán)糊精鍵合固定相適合于分子量小于200的藥物對(duì)映體的分析;而γ-環(huán)糊精鍵合固定相適用于較大分子量藥物對(duì)映體的分析。90年代以來(lái),又制備出一系列衍生化環(huán)糊精鍵合固定相,如乙?；?β,γ-CD、對(duì)甲苯酯-β-CD、氨基甲酸酯-β-CD等。CD衍生化提高了手性識(shí)別能力。一般用含甲醇、乙醇、乙腈作為有機(jī)改性劑的緩沖溶液作流動(dòng)相。最近Chang等提出了一種新型流動(dòng)相(MeCN、MeOH、HOAc、TEA),突破了傳統(tǒng)的正相或反相模式,使20多種過(guò)去難以分離的手性藥物對(duì)映體達(dá)到基線分離。2.2.4對(duì)映射體的手性識(shí)別纖維素三酯衍生物,如三苯基氨基酯涂敷在大孔硅膠上用作手性固定相,能直接分離許多對(duì)映體,該類(lèi)固定相的手性識(shí)別主要來(lái)自氨基甲酸酯或酯的部位與被拆分物之間形成氫鍵或偶極-偶極作用,或通過(guò)被拆分物分子進(jìn)入纖維素網(wǎng)狀腔,導(dǎo)致腔內(nèi)立體環(huán)境的改變而實(shí)現(xiàn)。纖維素衍生物作CSP常用的流動(dòng)相為甲醇-水、乙醇、乙醇-水、正己烷-異丙醇。2.2.5聚合物類(lèi)的用量該固定相使用最多的有兩種:一是在手性條件下不對(duì)稱(chēng)聚合,如用手性催合劑;二是用手性單體。用這兩種技術(shù),可制備有手性識(shí)別的聚合物,如聚甲基丙烯的三苯甲酯、聚酰胺等,這類(lèi)手性聚合物可涂漬或鍵合到硅膠上作CSP,光學(xué)活性聚氨酯類(lèi)主要用于分離含有芳香基團(tuán)的外消旋體;有螺旋鏈的聚甲基丙烯酸三苯甲酯涂敷在烷基化硅膠表面,在較廣泛的范圍內(nèi)可對(duì)消旋體進(jìn)行分離。這類(lèi)聚合物CSP柱容量和柱效都較高,但要求被分離藥物須有嚴(yán)格的立體構(gòu)型。2.2.6烯基質(zhì)的模擬冠醚源化合物有親水性內(nèi)腔和親脂性外殼,可鍵合在硅膠或聚苯乙烯基質(zhì)上制成手性固定相,根據(jù)主-客化學(xué)原理,用于含有能夠質(zhì)子化的伯胺功能團(tuán)的藥物對(duì)映體的分離,尤其是氨基酸及其衍生物的分離。流動(dòng)相多采用過(guò)氯酸水溶液中加入一定比例(≤5%)甲醇。2.2.7鍵合的金屬離子這類(lèi)CSP分離藥物對(duì)映體是基于固定相手性配體、金屬離