《透明質(zhì)酸鈉》規(guī)范

3QB/T4576—XXXX透明質(zhì)酸鈉本文件規(guī)定了透明質(zhì)酸鈉的鑒別、感官、理化、安全等要求，描述了相應(yīng)的試驗(yàn)方法，規(guī)定了檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存的內(nèi)容，并給出了分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量的信息。本文件適用于以葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等為原料，由馬鏈球菌獸疫亞種經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)而成的透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷(xiāo)售。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文本必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T602化學(xué)試劑雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB4789.2食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落菌數(shù)測(cè)定GB4789.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)GB4789.15食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)GB5009.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定GB5009.4-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定GB5009.11食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定GB5009.12食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB7718食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1透明質(zhì)酸鈉sodiumhyaluronate由β-D-N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸以β-1,3-糖苷鍵連接而成的雙糖結(jié)構(gòu)單元，再以β-1,4-糖苷鍵連成的一種鏈狀高分子酸性黏多糖透明質(zhì)酸的鈉鹽。4分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式4 QB/T4576—XXXX 4.1分子式(C14H20NNaO11)n4.2相對(duì)分子質(zhì)量80200-4010000（按2021年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量表）。4.3結(jié)構(gòu)式：HOCO2NO ONHH3CnOnH5要求5.1鑒別5.1.1透明質(zhì)酸鈉符合透明質(zhì)酸鈉的紅外吸收光譜特征。紅外吸收光譜圖與透明質(zhì)酸鈉標(biāo)準(zhǔn)紅外吸收光譜圖（圖1）一致。5.1.2鈉符合鈉鹽的焰色反應(yīng)特征，即火焰呈鮮黃色。5.2感官要求產(chǎn)品為白色或類(lèi)白色的粉末或顆粒，無(wú)正常視力可見(jiàn)雜質(zhì)。5.3理化指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1理化指標(biāo)5QB/T4576—XXXX5.4安全指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2安全指標(biāo)項(xiàng)目鉛（以Pb計(jì)）/（mg/kg）≤砷（以As計(jì)）/（mg/kg）≤霉菌和酵母/（CFU/g）≤菌落總數(shù)/（CFU/g）≤大腸菌群/（MPN/g）≤6試驗(yàn)方法6.1一般要求本文件所用試劑和水，在沒(méi)有注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖头螱B/T6682-2008規(guī)定的三級(jí)水。試驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒(méi)有注明其他要求時(shí)，均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的規(guī)定制備。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。6.2鑒別6.2.1透明質(zhì)酸鈉采用溴化鉀壓片法，取經(jīng)105℃烘箱烘干2h后樣品，使用壓片裝置，在常壓或真空條件下加壓成型制成透明狀片劑，利用紅外光譜儀進(jìn)行掃描，掃描范圍4000cm-1~400cm-1。對(duì)比樣品的紅外吸收光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)紅外吸收光譜圖。根據(jù)設(shè)備條件，亦可采用直接進(jìn)樣法。6.2.2鈉用鹽酸潤(rùn)濕鉑絲，在火焰上燃燒至無(wú)色，再用鹽酸潤(rùn)濕鉑絲后蘸取少許透明質(zhì)酸鈉樣品在火焰上燃燒，觀察火焰顏色。6.3感官取適量樣品，在自然光線下，用肉眼觀察樣品的顏色和形態(tài)。6.4透明質(zhì)酸鈉含量（以干基計(jì)）按附錄A或附錄B進(jìn)行測(cè)定，其中附錄A為仲裁法。6.5水分按GB5009.3-2016規(guī)定的第一法“直接干燥法”的步驟進(jìn)行測(cè)定，其中干燥時(shí)間為4h。6.6灰分6QB/T4576—XXXX按GB5009.4-2016規(guī)定的第一法“總灰分”進(jìn)行測(cè)定。6.7pH6.7.1試劑和溶液無(wú)二氧化碳蒸餾水：按GB/T603-2002中4.1.1.1規(guī)定制備。6.7.2儀器和設(shè)備pH計(jì)：精度為0.01。6.7.3測(cè)定步驟稱(chēng)取0.1g透明質(zhì)酸鈉樣品（精確至0.01g）加入100mL無(wú)二氧化碳蒸餾水，磁力攪拌或40℃水浴加熱等方式溶解，用pH計(jì)測(cè)定溶液的pH。結(jié)果保留一位小數(shù)。6.8鉛（以Pb計(jì)）按GB5009.12規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。6.9砷（以As計(jì)）按GB5009.11規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。6.10霉菌和酵母按GB4789.15規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。如樣品無(wú)法溶解，可添加適量無(wú)菌透明質(zhì)酸酶以助于樣品溶解。6.11菌落總數(shù)按GB4789.2規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。如樣品無(wú)法溶解，可添加適量無(wú)菌透明質(zhì)酸酶以助于樣品溶解。6.12大腸菌群按GB4789.3-2016中規(guī)定的MPN法進(jìn)行測(cè)定。如樣品無(wú)法溶解，可添加適量無(wú)菌透明質(zhì)酸酶以助于樣品溶解。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1一般要求產(chǎn)品按本文件規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，合格的產(chǎn)品附有生產(chǎn)廠質(zhì)量檢測(cè)部門(mén)簽發(fā)的質(zhì)量合格證明，方可出廠。7.2組批以同一次投料生產(chǎn)、同一規(guī)格、同一品種的均一質(zhì)量的產(chǎn)品為一批。7.3抽樣與留樣7.3.1抽樣從整批產(chǎn)品中抽取樣品時(shí)，應(yīng)先從整批中抽取若干包裝單位，然后再?gòu)某槌龅陌b單位7QB/T4576—XXXX中抽取均勻試樣。取樣數(shù)量按照表3執(zhí)行。表3產(chǎn)品抽樣表批量范圍（最小外包裝單位）抽取樣本數(shù)（最小外包裝單位）每個(gè)樣本抽取單位包裝數(shù)a（瓶、袋）＜10021100~50041>50061a單位包裝數(shù)指大包裝中的小包裝單位7.3.2取樣方法取樣時(shí)，用清潔、干燥的取樣工具插入包裝袋的三分之二。每袋取樣100g，將抽取的樣品迅速混勻，用四分法縮分，然后分裝于兩個(gè)清潔干燥的取樣袋中，密封。貼上標(biāo)簽，一份用于檢測(cè)，另一份密封儲(chǔ)存?zhèn)洳椤?.4出廠檢驗(yàn)出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目為感官、透明質(zhì)酸鈉含量（以干基計(jì)）、pH、水分、菌落總數(shù)、霉菌和酵母和大腸菌群。7.5型式檢驗(yàn)型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為本文件要求中規(guī)定的全部項(xiàng)目。一般情況下，型式檢驗(yàn)每6個(gè)月進(jìn)行1次。有下列情況之一時(shí)，亦應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：a)原輔材料有較大變化時(shí)；b)更改關(guān)鍵工藝或設(shè)備時(shí)；c)新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn)3個(gè)月后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d)出廠檢驗(yàn)與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí)；e)國(guó)家監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)按有關(guān)規(guī)定需要抽檢時(shí)。7.6判定規(guī)則檢驗(yàn)結(jié)果若發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品有一項(xiàng)不符合本文件要求時(shí)，應(yīng)重新從兩倍量包裝中抽取樣品進(jìn)行復(fù)驗(yàn)，以復(fù)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。如仍有一項(xiàng)不合格，則判該批產(chǎn)品為不合格品。檢驗(yàn)結(jié)果若發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品有兩項(xiàng)及以上不符合本文件要求時(shí)，則判該批產(chǎn)品為不合格品。8標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存8.1標(biāo)志外包裝標(biāo)志應(yīng)符合GB/T191的規(guī)定。預(yù)包裝產(chǎn)品標(biāo)簽應(yīng)符合GB7718的規(guī)定。對(duì)有特殊要求的標(biāo)志，按需方要求進(jìn)行標(biāo)志。8.2包裝應(yīng)采用符合相應(yīng)行業(yè)產(chǎn)品包裝要求的包裝材料，經(jīng)檢驗(yàn)合格后方可使用。嚴(yán)格密封，以防產(chǎn)品吸潮和漏出。對(duì)有特殊要求的包裝，按需方要求進(jìn)行包裝。8.3運(yùn)輸8QB/T4576—XXXX運(yùn)輸工具應(yīng)清潔；不應(yīng)與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混裝、混運(yùn)，避免受潮、受壓、曝曬；裝卸時(shí)應(yīng)輕搬、輕放。8.4貯存產(chǎn)品應(yīng)貯存在干燥、通風(fēng)的常溫倉(cāng)庫(kù)內(nèi)，嚴(yán)禁與有毒有污染的物品或其他雜物混存。9QB/T4576—XXXX（規(guī)范性）透明質(zhì)酸鈉含量分光光度計(jì)法A.1原理透明質(zhì)酸中含有等量摩爾比的N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸，用硼砂作催化劑對(duì)透明質(zhì)酸鈉用硫酸進(jìn)行酸解，能將葡萄糖醛酸分離出來(lái)。葡萄糖醛酸與咔唑反應(yīng)形成有機(jī)絡(luò)合物，該絡(luò)合物顯示特有的紫色，其吸光度和葡萄糖醛酸的濃度成正比。通過(guò)葡萄糖醛酸的含量能確定透明質(zhì)酸鈉的含量。A.2試劑和溶液A.2.1標(biāo)準(zhǔn)品：D-葡萄糖醛酸，CAS6556-12-3，純度不小于98%。A.2.2濃硫酸：優(yōu)級(jí)純。A.2.3咔唑。A.2.4硼砂。A.2.5無(wú)水乙醇。A.2.6咔唑乙醇溶液（0.1%）：稱(chēng)取0.125g咔唑（精確至0.001g）溶于100mL無(wú)水乙醇中，置于棕色瓶中。4℃~8℃防爆冰箱保存，有效期2個(gè)月；或室溫下避光保存，有效期15A.2.7D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2mg/mL精確稱(chēng)取20mgD-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品（按實(shí)際純度折算，精確至0.0001g），置100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻備用。A.2.8硼砂-硫酸溶液（0.025mol/L）：稱(chēng)取4.77g硼砂（精確至0.001g）溶于500mL濃硫酸中，保存于密封的玻璃細(xì)口瓶中備用。A.3儀器和設(shè)備A.3.1旋渦混合器。A.3.2分光光度計(jì)，可測(cè)定530nm波長(zhǎng)下的吸光度。A.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別量取葡萄醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（A.2.7）0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，置于濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取6只具塞刻度試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0mL，之后分別加入硼砂硫酸液5.0mL，置冰浴中冷卻15min。先輕輕振搖，再用旋渦混合器充分混勻。將試管置沸水中加熱10min，取出再置于冰水浴或流水中冷卻至室溫。分別加入咔唑溶液(A.2.6）0.2mL于冷卻后的試管中，混勻，沸水浴中再加熱15min后，冷卻至室溫。比色皿于530nm處測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。A.5分析步驟A.5.1稱(chēng)取透明質(zhì)酸鈉樣品約0.1g（m，精確至0.0001g）于具塞錐形瓶中，加水至100g（w1，精確至0.01g磁力攪拌至充分溶解。再稱(chēng)取上述溶液約4.0g（w2，精確至0.01g）置50mL（V）容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。QB/T4576—XXXXA.5.2吸取lmL樣品溶液，加入5mL硼砂硫酸液，置冰浴中冷卻15min。先輕輕振搖，再用旋渦混合器充分混勻。將試管置沸水中加熱10min，再置于冰水浴或流水中冷卻至室溫。分別加入0.2mL咔唑試液，混勻，沸水浴中再加熱15min，之后冷卻至室溫。以lcm比色皿用分光光度計(jì)于530nm處測(cè)定吸光度。A.6計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量（以干基計(jì)）按公式（1）計(jì)算。..................................................(A.1)式中：X2——樣品中透明質(zhì)酸鈉含量（以干基計(jì)），單位為克每百克（g/100g）；c——根據(jù)樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄醛酸濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；w1——樣品溶液的質(zhì)量，單位為克（g）；10-6——微克和克的轉(zhuǎn)換系數(shù)；V——樣品定容的體積，單位為毫升(mL)；100——克和百克的轉(zhuǎn)換系數(shù)；401.3——透明質(zhì)酸鈉雙糖結(jié)構(gòu)單元的相對(duì)分子質(zhì)量；w2——移取樣品溶液的質(zhì)量，單位為克（g）；m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）；w3——樣品的水分，單位為克每百克（g/100g）；194.1——D-葡萄糖醛酸的相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果保留至1位小數(shù)。A.7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的2%。QB/T4576—XXXX（規(guī)范性）透明質(zhì)酸鈉含量高效液相色譜法B.1原理透明質(zhì)酸酶能作用于透明質(zhì)酸鈉的β-1,4-糖苷鍵，使透明質(zhì)酸鈉水解產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖-葡萄糖醛酸雙糖，利用高效液相色譜法測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖-葡萄糖醛酸雙糖產(chǎn)物的含量。以透明質(zhì)酸鈉的濃度為橫坐標(biāo)，透明質(zhì)酸鈉水解生成的N-乙酰氨基葡萄糖-葡萄醛酸雙糖峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)水解生成的N-乙酰氨基葡萄糖-葡萄醛酸雙糖峰面積能計(jì)算樣品中透明質(zhì)酸鈉的含量。B.2試劑和耗材B.2.1透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品（CAS：9067-32-7，純度不小于99%）B.2.2透明質(zhì)酸酶（酶活不小于4000IU/mL）B.2.3二水合磷酸二氫鈉NaH2PO4?2H2OB.2.4十二水合磷酸氫二鈉Na2HPO4?12H2OB.2.5磷酸H3PO4B.2.6磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L，pH6.0稱(chēng)取27.4g二水合磷酸二氫鈉（B.2.3）和8.8g十二水合磷酸氫二鈉（B.2.4）于1000mL燒杯中，用水溶解后轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用1mol/L磷酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.0，加水定容，并搖勻。B.2.7透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品溶液（1.0mg/mL稱(chēng)取50mg透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品（按實(shí)際純度折算，精確至0.1mg）于容量瓶中，加入40mL磷酸鹽緩沖溶液溶解，超聲至充分溶解后，磷酸鹽緩沖溶液定容并搖勻。B.2.8透明質(zhì)酸酶溶液（1000IU/mL）：移取適量透明質(zhì)酸酶（B.2.2）于10mL容量瓶中，磷酸鹽緩沖液溶解并定容?，F(xiàn)用現(xiàn)配。B.2.9流動(dòng)相（1%磷酸溶液）：移取10.0mL磷酸（B.2.5）于800mL水中，混勻后轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加水定容并混勻。B.3儀器與設(shè)備B.3.1高效液相色譜，配有紫外檢測(cè)器。QB/T4576—XXXXB.3.2色譜柱：磺化交聯(lián)苯乙烯二乙烯基苯共聚物強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱（300mm×8mm或其他等效色譜柱。B.3.3參考色譜條件：流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：232nm。B.4分析步驟B.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別移取透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品溶液0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于15mL具塞刻度試管中，加入磷酸鹽緩沖溶液（B.2.6）至9mL，然后加入1mL透明質(zhì)酸酶（B.2.8混勻，37℃~42℃水浴中酶解1h。沸水浴2min，終止反應(yīng)。冷卻至室溫后，用0.22μm濾膜過(guò)濾，按B.3.3所述色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。對(duì)照品溶液濃度分別為0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.200mg/mL。以透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品系列工作液溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.4.2樣品前處理稱(chēng)取0.1g樣品（精確至0.001g）至100mL容量瓶中，加入80mL磷酸鹽緩沖溶液后，42℃水浴超聲至充分溶解后磷酸鹽緩沖溶液定容。B.4.3酶解反應(yīng)移取0.5mLB.4.2處理后的樣品溶液至15mL具塞刻度試管中，加入8.5mL緩沖溶液。再加入1.0mL透明質(zhì)酸酶溶液，并混勻，37℃~42℃水浴中酶解1h。然后沸水浴2min，終止反應(yīng)。冷卻至室溫。B.4.4測(cè)定移取適量B.4.3處理后酶解液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。濾液按照B.3.3的色譜條件進(jìn)行分析，并記錄峰面積。B.5計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量（以干基計(jì)）按公式（2）計(jì)算：其中：....................................（B.1）X——透明