全蝎藥對(duì)纖維蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠腸黏膜免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用

全蝎藥對(duì)纖維蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠腸黏膜免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ra）是人體四肢關(guān)節(jié)滑膜中炎癥細(xì)胞浸潤引起的骨軟骨破壞，屬于中醫(yī)學(xué)范疇。全蝎蜈蚣為治療RA的經(jīng)典藥對(duì),廣泛地應(yīng)用于治療的中藥復(fù)方中,治療效果明確而顯著,但其作用機(jī)制不明,是制約全蝎、蜈蚣在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中運(yùn)用的瓶頸之一。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是指分布于機(jī)體胃腸道黏膜的淋巴組織,包括派伊爾結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)以及分散在黏膜固有層和腸上皮中的大量淋巴細(xì)胞,通過激活腸道黏膜免疫產(chǎn)生的免疫耐受或者免疫抑制,是治療包括RA在內(nèi)自身免疫性疾病的可能途徑之一,大量的報(bào)道已經(jīng)表明CII誘導(dǎo)免疫耐受可明顯推遲實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病時(shí)間,減少發(fā)病率和減少關(guān)節(jié)炎受累關(guān)節(jié)數(shù),減輕關(guān)節(jié)炎炎性損傷而有效治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎,其可能機(jī)制是通過釋放抑制性細(xì)胞因子阻止免疫病理反應(yīng)。這些研究為從黏膜免疫探索全蝎蜈蚣治療RA的作用機(jī)制提供了新的思路和方法。1材料表面1.1私家車、江蘇等人添加制備全蝎、蜈蚣購于江西省黃慶仁華氏大藥房,全蝎產(chǎn)于山東,蜈蚣產(chǎn)于江蘇。各等分研末,加適量生理鹽水混勻,質(zhì)量濃度為0.4g·mL-1,置4℃下冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ薪M胺含量為0.001%,蜈蚣中組胺含量為0.56%。1.2動(dòng)物的測(cè)定Wistar大白鼠60只,雌性,體重(160±20)g,購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào)SCXK(滬)2008-0016。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。1.3接口外接收劑液態(tài)牛II型膠原蛋白(CII,批號(hào)2002-2)、CII凍干粉(批號(hào)2002-1)及不完全弗氏佐劑(批號(hào)7002)均購于Chondrex公司。FITC-anti-CD3mAb(IgG3)(批號(hào)11-0030-82),PE-anti-CD4mAb(IgG2a)(批號(hào)17-0040-82),PE-anti-CD8amAb(IgG1)(批號(hào)11-0030-82)均購于eBioscience公司。TGF-β1(批號(hào)BMS623),sIgA(批號(hào)40-374-130007)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒分別購于Bender,Genway公司。1.4流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀LD5-2A離心機(jī)及FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司),酶標(biāo)儀(ThermoMultiskanMK3),1575型洗板機(jī)(BDRAD制造)。2方法2.1冰浴溫度對(duì)乳化效果的影響參照文獻(xiàn)的報(bào)道并適當(dāng)改進(jìn),將液態(tài)CII與等量完全弗氏佐劑混合(CII的終質(zhì)量濃度為1g·L-1)。用高速攪拌儀在冰浴狀態(tài)下混勻,直至混合物完全、充分乳化(以乳化物滴入水中不松散為度)。取乳化后的混合物于大鼠尾根皮下注射,100μg/只,注射后第7天,以相同劑量、相同部位再次免疫,即造模成功。2.2全蟹、瞳高、中、低劑量組cii、is、多單次給藥后全蟹磷蝦混懸液對(duì)大鼠其它高、中、低劑量組見表1將雌性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、全蝎蜈蚣高、中、低劑量組和CII組。于第8天,按體重?fù)Q算,全蝎、蜈蚣高、中、低劑量組分別給予全蝎蜈蚣混懸液0.4,0.2,0.1g·kg-1,CII組予II型膠原蛋白凍干粉60μg·kg-1ig;正常對(duì)照組和模型對(duì)照組分別ig等容積生理鹽水,連續(xù)給藥40d。2.3單克隆抗體與cd3和cd8單克隆抗體分離培養(yǎng)用眼科彎剪剪下PP結(jié),置于盛有D-Hank’s液的平皿中,4℃?zhèn)溆?。用機(jī)械擠壓的方式從剪下的PP結(jié)中分離出淋巴細(xì)胞,用300目的尼龍網(wǎng)過濾,用D-Hank’s將其過濾液細(xì)胞密度調(diào)整為5×106/mL,分別取細(xì)胞懸液100μL與CD3(0.5μg)/CD4單克隆抗體(0.25μg)和CD3(0.5μg)/CD8單克隆抗體(0.125μg)的離心管中震勻,4℃下孵育30min;加入適量生理鹽水,以1000r·min-1離心1.5min,反復(fù)幾次,棄其上清,加生理鹽水恢復(fù)體積至500μL,過濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2.4結(jié)腸tgf-1,siga的含量分離小腸,制作小腸組織勻漿,參照試劑盒的說明書檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中TGF-β1,sIgA的含量。待測(cè)上清液、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)抗體使用量均為100μL,波長450nm下測(cè)定吸光度(A)。2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢測(cè)結(jié)果均以表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1正常組和正常組治療前后足加快關(guān)節(jié)損傷評(píng)分比較在第1次免疫造模后20余日,模型組大鼠即可見關(guān)節(jié)紅腫、變形、行動(dòng)不利等癥狀,紅腫起于足趾關(guān)節(jié),甚至踝關(guān)節(jié),其關(guān)節(jié)損傷評(píng)分、足爪容積及病理損傷評(píng)分均明顯高于正常組。給藥40d后,一定劑量全蝎蜈蚣治療組及CII組均有明顯下降并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明全蝎蜈蚣可有效治療大鼠膠原免疫性關(guān)節(jié)炎。3.2cd4+t、cd8+t細(xì)胞6+t細(xì)胞cd4+t細(xì)胞與正常組比較,模型組大鼠腸道PP結(jié)淋巴細(xì)胞中CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降(P<0.05),而CD4+T細(xì)胞有上升趨勢(shì),CD8+T細(xì)胞有下降趨勢(shì),CD4/CD8則顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,各治療組對(duì)CD3+T淋巴細(xì)胞作用不明顯,均可明顯下調(diào)CD4+,CD8+T細(xì)胞水平,升高CD4/CD8,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(表1)。3.3tgf-1表達(dá)TGF-β1表達(dá)方面,與正常組比較,模型組大鼠小腸中TGF-β1表達(dá)明顯升高,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,僅中劑量組及CII組TGF-β1表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)。sIgA水平方面,與正常組比較,模型組大鼠小腸中sIgA水平明顯降低,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與模型組比較,除中劑量組外,其他各治療組小腸組織勻漿sIgA水平均明顯上升,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。4全蟹瞳的免疫抑制作用腸集合淋巴結(jié)(peyer’spatches,簡(jiǎn)稱PP結(jié))是分布于腸系膜緣對(duì)側(cè)腸壁黏膜或黏膜下,由多個(gè)淋巴濾泡聚集成高度器官化的黏膜相關(guān)淋巴組織,含有各種必需的免疫活性細(xì)胞,是黏膜免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)部位。在本試驗(yàn)中,各治療均可分別降低CIA大鼠小腸PP結(jié)中CD4+,CD8+T淋巴細(xì)胞水平,表明全蝎蜈蚣聯(lián)合給藥使得CIA大鼠黏膜免疫系統(tǒng)維持抑制狀態(tài)下的平衡,恢復(fù)免疫耐受,從而達(dá)到治療效果。TGF-β1是一種具有雙重生物效應(yīng)可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化的多肽因子,在RA滑膜與血清中表達(dá)異常及與其他細(xì)胞因子的相互作用與其發(fā)病機(jī)制、病理改變、治療及預(yù)后均密切相關(guān),其在炎癥早期促進(jìn)炎癥發(fā)展,且在炎癥部位活性增強(qiáng),使成纖維細(xì)胞大量增殖,導(dǎo)致局部嚴(yán)重纖維化,同時(shí)發(fā)揮免疫抑制作用。在我們的試驗(yàn)中,全蝎蜈蚣聯(lián)合用藥在一定劑量下可抑制其在小腸黏膜局部的表達(dá),減少TGF-β1分泌,有報(bào)道表明TGF-β1可以滲透到關(guān)節(jié)局部,趨化和激活單核細(xì)胞,并使T細(xì)胞遷移至炎癥局部,從而加重滑膜炎癥,故全蝎蜈蚣具有降低小腸黏膜局部TGF-β1表達(dá),進(jìn)而防止或緩解炎癥加重的可能。sIgA是腸黏膜相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生的免疫球蛋白,其清除抗原而不激活系統(tǒng)免疫的獨(dú)特免疫穩(wěn)定作用,是維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的第一道防線。我們的實(shí)驗(yàn)表明全蝎蜈蚣在一定劑量下可促進(jìn)sIgA分泌,黏膜防御進(jìn)一步增強(qiáng),有利于自身抗原的清除而緩解自身免疫性損傷。我們的研究表明全蝎蜈蚣調(diào)節(jié)膠原免疫性關(guān)節(jié)炎黏膜免疫的作用可能通過調(diào)節(jié)小腸黏膜局部PP結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群平衡,降低腸黏膜TGF-β1和升高sIgA表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的,同時(shí)鑒于小劑量組胺可抑制促炎因子如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素12等產(chǎn)生和促進(jìn)抗炎因子(IL-4,