禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測(cè)定高效液相色譜法

禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測(cè)定高效液相色譜法1.范圍本文件規(guī)定了禽蛋中卵黃免疫球蛋白（IgY）的高效液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于禽蛋（雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋、鴿蛋等）中卵黃免疫球蛋白（IgY）的測(cè)定。2.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3.術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4.原理根據(jù)禽蛋中卵黃免疫球蛋白（IgY）的水溶特性和蛋白質(zhì)分子大小差異，采用水稀釋法結(jié)合超聲沉淀分離后進(jìn)行高效液相凝膠色譜測(cè)定，依據(jù)紫外光譜和保留時(shí)間定性、外標(biāo)法定量測(cè)定。5.試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2鹽酸溶液（1.0mol/L）：量取90mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。5.3磷酸氫二鈉溶液（0.2mol/L）：稱(chēng)取71.6g十二水合磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000mL。5.4磷酸二氫鈉溶液（0.2mol/L）：稱(chēng)取31.2g二水合磷酸二氫鈉，用水溶解，定容至1000mL。5.5磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH6.6）：取625mL0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（5.4），375mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液（5.3），1000mL水混合。5.6含0.1mol/LNa2SO4的磷酸鹽緩沖液：稱(chēng)取14.2g無(wú)水硫酸鈉用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）（5.5）溶解并定容至1000mL，過(guò)0.45μm濾膜。5.7卵黃免疫球蛋白（ImmunoglobulinofYolk，IgY）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，附證書(shū)，純度97%，保存條件：-20℃±5℃，避光保存。5.8IgY標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500gIgY標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確至0.0001g），用0.1mol/LNa2SO4磷酸鹽緩沖液（5.6）溶解并定容至25.00mL，搖勻，配制成20.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃±5℃條件下避光保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月。5.9材料：微孔濾膜，孔徑0.22μm，水相。6.儀器設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器。6.2天平：感量0.0001g及感量0.01g。6.3pH計(jì)：精度為0.01。6.4勻漿機(jī)。6.5渦旋振蕩器。6.6超聲波清洗儀：功率150W。6.7冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于6000r/min，溫度0℃~4℃。7.試樣制備在同一批次中取6個(gè)~10個(gè)禽蛋樣品，鴿蛋、鵪鶉蛋可適當(dāng)增加樣品數(shù)量。洗凈去殼，分離蛋清蛋黃，將蛋黃置于濾紙上輕輕滾動(dòng)吸去蛋黃膜上附著的蛋清，用鑷子刺破蛋黃膜將蛋黃液收集于燒杯中，勻漿機(jī)攪拌均勻后裝入聚乙烯瓶中，蛋黃樣品不少于20g，作為試樣，于4℃冷藏保存。8.測(cè)定步驟8.1提取與凈化準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣2.00g（精確至0.01g）于25mL比色管中，加入純水稀釋并定容至刻度線(xiàn)，振搖混勻后，用1.00mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.00±0.05。冰浴條件下超聲30min，0℃~4℃冷藏靜置12h，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，加入5.00mL正己烷，振搖混勻后，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，棄去上層正己烷，取1mL~2mL溶液過(guò)0.22μm濾膜，所得濾液供高效液相色譜檢測(cè)分析用。8.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)制備移取適量IgY標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1mol/LNa2SO4磷酸鹽緩沖液稀釋配制濃度為0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL、4.00mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，供高效液相色譜測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，現(xiàn)配現(xiàn)用。8.3測(cè)定8.3.1高效液相色譜參考條件a)色譜柱：凝膠色譜柱，7.8mm（ID）30.0cm（L），或同等性能色譜柱。b)流動(dòng)相：80%A：含0.1mol/LNa2SO4的磷酸鹽緩沖液（5.6）；20%B：乙腈。c)流速：0.8mL/min，等度洗脫。d)檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。e)進(jìn)樣量：20μL。f)柱溫：25℃±5℃。8.3.2定性選擇280nm波長(zhǎng)檢測(cè)，試樣與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間相對(duì)偏差±2.5%之內(nèi)，則判定試樣中存在IgY。8.3.3定量以標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgY峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，用外標(biāo)單點(diǎn)法或標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)法對(duì)試樣中的IgY進(jìn)行定量測(cè)定。上述色譜條件下，IgY標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖A.1。9.計(jì)算試樣中IgY含量X，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為毫克每克（mg/g），按式（1）或式（2）計(jì)算：?jiǎn)吸c(diǎn)校準(zhǔn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)校準(zhǔn)：（2）式中：X——試樣中IgY含量，單位為毫克/克（mg/g）；Ai——試樣中測(cè)得的IgY色譜峰面積；AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中測(cè)得的IgY色譜峰面積；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V1——稀釋液體積，單位為毫升（mL）；CS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgY的濃度，單位為毫克/毫升（mg/mL）；Ci——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)得出的試樣溶液中的IgY濃度，單位為毫克/毫升（mg/mL）。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，平行測(cè)定的算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果，保留3位有效數(shù)字。10.回收率和精密度參見(jiàn)表B。附錄A色譜圖（資料性附錄）2.00mg/mLIgY標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖A.1，5種禽蛋基質(zhì)的實(shí)際測(cè)定液相色譜圖見(jiàn)A.2圖A.12.00mg/mLIgY標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（λ280nm）

eeacdb圖A.2不同禽蛋樣品液相色譜圖（a：雞蛋；b：鵪鶉蛋；c：鴿子蛋；d：鴨蛋；e：鵝蛋）

附錄BIgY的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（資料性附錄）5種禽蛋基質(zhì)中IgY的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見(jiàn)表B表B5種禽蛋基質(zhì)中IgY的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）基質(zhì)名稱(chēng)檢測(cè)物質(zhì)添加濃度（mg/g）回收率范圍/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%雞蛋IgY583.3~85.71.21076.6~81.42.72078.2~80.21.0鵪鶉蛋1.589.7~105.35.4388.5~99.64.6686.3~90.51.7鴿子蛋579.6~87.64.31078.9~82.