免疫組化實驗方法

免疫組化實驗方法免疫組織化學的概念利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑

（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。2最突出的優(yōu)點在更廣闊的范圍內(nèi)，把結構與功能及代謝結合起來，在微觀世界原位地確定組織及細胞結構的化學成分，達到方法統(tǒng)一，定性可靠，定位準確，定量可能。3免疫組化實驗標本組織標本（石蠟切片和冰凍切片）細胞標本（組織印片、細胞爬片和細胞涂片）。石蠟切片對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔；4細胞和組織的固定1．固定的作用--使細胞內(nèi)蛋白質凝固、終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，最大限度地保存細胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?．選擇最佳固定液的標準：保持組織形態(tài)結構；保存抗原性。（1）醛類固定劑：穿透性較強，收縮性小，是常用的固定劑。如10％中性福爾馬林液、4％多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇類固定劑：沉淀蛋白質和糖，保存抗原性較好。但對低分子蛋白質、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（適用于動物實驗研究）

組織新鮮勿干燥體積適中固定液足夠（>20倍）5抗體常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。特性比較：均一性2.穩(wěn)定性

3.特異性4.重復性5.沉淀反應6熒光素標記抗體

能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素。必備條件:③熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。

④結合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響，用于活體內(nèi)標記，結合物應無毒，附加抗原性小。7常用的染色方法根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法按標記物定位于抗原所在部位的手段，則可將免疫細胞組織化學染色方法分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法等。每進行一步結合反應。都會產(chǎn)生一次陽性結果的放大效應。敏感性由高到低依次為橋連法、間接法、直接法。8染色的基本程序①標記抗體與標本中抗原反應結合；②用緩沖液洗去未結合的成分；③直接觀察結果；或顯色后再用顯微鏡觀察。9反應條件抗原抗體結合屬于可逆性反應，具有共性的反應條件：（1）PH：中性及弱鹼性條件（PH7～8）有利于免疫復合物的形成（2）離子強度：0.01～0.02M的低離于強度有利于免疫復合物的形成（3）去污劑：有利于復合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20，EDTA（0.01%），TritonX-100（0.1～1%）（4）抗體稀釋液中蛋白質濃度：稀釋液中含無關蛋白質可以減少抗體的非特異吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐劑：微生物生長會干擾抗原抗體反應，稀釋液和抗體液中加入適量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐（6）溫度和時間：較高的反應溫度（37℃）可加速抗原抗體結合反應，低溫有利于抗原抗體結合率的提高（7）洗滌：除去未結合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色。選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10熒光素

1，異硫氰酸熒光黃（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）黃色、橙黃色或褐黃色結晶粉末，最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。最常用。2．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyante，TRITC）紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明。3．四乙基羅丹明（tetraethylrhodamineB200，RB200）褐紅色粉未，最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596～600nm，呈橙紅色熒光。價廉。11染色注意事項（1）在濕盒內(nèi)進行，以免標本上的試劑干燥。（2）酸堿度以接近體液環(huán)境為宜（PH7.4左右）（3）組織細胞要求新鮮，最好使用冷凍切片，固定存檔標本要求組織結構完好。（4）切片經(jīng)染色后，應及時觀察并照相。切片在4℃冰箱內(nèi)過夜，其熒光強度將減弱約30％。（5）調整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景非特異性染色最小為標準，對每一批抗體必須試驗摸索，找出最佳稀釋度。（6）所購抗體應及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù)。12酶標抗體法通過共價鍵將酶結合在抗體上制成酶標抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進行細胞或組織表面或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察。常用的酶--辣根過氧化物酶（HRP），堿性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。優(yōu)點：與免疫熒光技術相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經(jīng)鋨酸處理后，電子密度增強，可用于電鏡觀察。13抗生物素-生物素-過氧化物酶技術

(avidin-biotinperoxidasecomplexABC)原理：利用抗生物素分別連接生物素標記的第2抗體和生物素標記的酶。其第1抗體不為標記物所標記，生物素標記的第2抗體與ABC復合物相連接。ABC復合物是將過氧化物酶結合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應而制備的。常用：AB