實驗五：酶聯(lián)免疫吸附法測定抗血清效價

實驗五

酶聯(lián)免疫吸附法測定抗血清效價

一、目的學習和掌握ELISA的基本原理間接ELISA重點掌握測定抗體效價的方法

測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。二、原理

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。

其方法簡單，方便訊速，特異性強。二、酶及其底物酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應.ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

抗原酶標抗體底物直接法原理

首先將抗原或抗體吸附在一個合適的固體載體表面上，洗滌

然后以酶標記的抗原或抗體與被吸附的相應抗體或抗原結合形成有酶標記的抗原-抗體復合物，洗滌

當加入適合底物時，復合物上的酶即催化底物發(fā)生反應，產(chǎn)生帶色的產(chǎn)物。因在一定條件下，酶降解底物的量與呈現(xiàn)的色澤成正比關系，因此通過分光光度計測定色度，即可計算出參與反應的抗原或抗體的含量。抗原一抗酶標二抗底物間接法間接法的原理先將抗原吸附于載體表面，洗去未吸附的部分，然后加入待測血清，使其中的特異抗體蛋白（第一抗體）與抗原結合物，再洗去未結合的部分，加入酶抗體的抗體（第二抗體，即第一抗體的抗體），與抗原-抗體復合物相結合，產(chǎn)生酶標記的免疫復合物，洗去未結合的酶標記物，加入底物，在酶的催化下產(chǎn)生有色物質，通過比色測定光密度值，即可算出抗血清中抗體的存在量?？寡逍r制備的免疫血清，必需進行效價的測定?？寡宓男r：它與一定量抗原作用時出現(xiàn)肉眼可見顏色反應的最大稀釋度。分光光度計測定法：應用一系列連續(xù)稀釋的抗血清，與固定的抗原反應，分析計算出現(xiàn)顏色的最大稀釋度（吸光度差值需大于0.05）。三、操作步驟1.包被：96孔板包被適量BSA（100ul），4℃過夜。2.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。3.一抗孵育：加入稀釋的一抗（100ul），37℃孵育1hr。4.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。5.二抗孵育：加入稀釋的酶標二抗（100ul），37℃孵育30min。6.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。7.顯色反應：加入顯色液200ul，避光顯色15min。8.終止：加入2N(N:當量濃度)H2SO4

50ul，終止反應。9.測定：酶標儀讀數(shù)（OD490讀數(shù)