不同消化時間下膠原酶對人臍帶間充質干細胞分離的影響

不同消化時間下膠原酶對人臍帶間充質干細胞分離的影響目的：比較膠原酶的不同消化時間，觀察所獲得的間充質干細胞的數(shù)量，擬定最為抱負的消化時間。辦法：分別采用3h、5h、7h的消化時間分離臍帶間充質干細胞；通過傳代進行純化和擴增培養(yǎng)，繪制生長曲線；用流式細胞儀檢測其表面標志。成果：分離出的間充質干細胞貼壁后為梭形，呈平行排列生長或漩渦狀生長，并且消化時間為5h時收獲到的細胞數(shù)量最多；流式細胞儀檢測成果顯示，獲得的間充質干細胞均體現(xiàn)CD73、CD105、HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45、HLA-DR。結論：膠原酶消化法從人臍帶中分離培養(yǎng)的細胞含有間充質干細胞的生物學特性，并且消化5h收獲得的間充質干細胞數(shù)量最多，生長狀況最佳。標簽：膠原酶；臍帶；間充質干細胞；分離；消化時間TheimpactofdifferentcollagenasedigestiontimeonUCMSCsseparationHAOShi-kai，SUXiang-xiang，HONGJing-xinUNIONSTEMCELL&GENEENGINEERINGCO.LTD，Tianjin300384，ChinaAbstract：ObjectiveComparingthequantityofMSCsacquiredfromumbilicalcordthatdigestedbycollagenaseIIindifferenthours，ascertainanidealdigestingtimeandcultureandappraisethecellsacquired.MethodsMSCswereisolatedfromhumanumbilicalcordthroughcollagenasedigestionrespectivelyin3h，5h，7h，thenpassagedtopurifyandculture，drewthegrowthcurve.Theirsurfacemarkersandcellscycleweredetectedbyflowcytometry.ResultsMSCsisolatedfromumbilicalcordadheredwithaspindle-shape，theyparallelalongtheirlongitudinalaxisorgrewinwhirlmanner.After5hoursdigestion，wegotthebiggestquantitywithbestgrowthstatus，andsuccessfullybuiltthemethodforMSCscultureandincreasing.Detectedbyflowcytometry，allofadherentcellsexpressCD73、CD105、HLA-ABC，noneofthemexpressCD34、CD45、HLA-DR.ConclusionCellsisolatedfromumbilicalcordbydigestionhavethebiologicalcharacteristicsofMSCs.And5hoursisthebesttimefordigestiontoacquirethemostandbestMSCs.Keywords：Collagenase；Umbilicalcord；MesenchymalStemCells；Isolate；Digestiontime間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一種多潛能干細胞，含有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能，在人體生長、發(fā)育過程中存在于多個組織中。現(xiàn)在，MSCs重要來源于人骨髓，但成人骨髓中MSCs容易被病毒感染，且強的免疫原性等因素限制了其臨床應用[1]。另外骨髓來源的間充質干細胞還存在下列問題：隨著年紀的老化，干細胞數(shù)目明顯減少，增殖分化能力大幅度衰退；制備過程不容易質控；移植給異體可能引發(fā)免疫反映；取材時對患者有損傷，患者有骨髓疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質干細胞臨床應用，使得尋找骨髓以外其它可替代的間充質干細胞來源成為一種重要的問題[2]。近來，在人的臍帶中也發(fā)現(xiàn)了間充質干細胞，因其來源豐富、易于獲得、不存在倫理問題，有望成為組織工程抱負的種子細胞[3]。對UCMSC（臍帶干細胞）進行的體內研究成果很令人鼓舞，將其移植到重度肌肉損傷的小鼠模型中，供體細胞的蛋白質體現(xiàn)譜含有骨骼肌分化的特性，并能增強肌肉再生[4]。將UCMSC移植入小鼠缺血的大腦中能改善受體的神經功效，有證據(jù)表明供體細胞分化為神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞。這同體外培養(yǎng)時所體現(xiàn)的多潛能相一致，并且移植能增進血管形成和增加缺血損傷部位的血流，該研究表明移植UCMSC能夠發(fā)揮多個臨床功效[5]?，F(xiàn)在，國際干細胞治療學會提出了鑒定人來源間充質干細胞的3條最低原則[6]：①在原則培養(yǎng)條件下，間充質干細胞含有對塑料底壁的貼附性；②間充質干細胞群體體現(xiàn)CD105、CD73及CD90，而不體現(xiàn)造血細胞標志物CD45和CD34；③經體外誘導，間充質干細胞能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞等分化。這僅僅是間充質干細胞的體外鑒定原則，某些研究者始終謀求間充質干細胞的體內鑒定[7]原則。間充質干細胞在組織中的比例極低，因此，如何獲取高純度的間充質干細胞相稱重要?，F(xiàn)在最慣用的分離間充質干細胞的辦法有貼壁培養(yǎng)法、膠原酶法、胰酶-膠原酶法，某些實驗研究者通過組織塊培養(yǎng)法收獲的原代細胞產量比對應的酶消化法要多且成功率高，減少了培養(yǎng)的成本和難度，避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入，進而減少其臨床排斥反映[8]。本研究從足月胎兒臍帶中分離出MSCs，通過比較不同消化時間對所收獲間充質干細胞的影響，并觀察和研究其形態(tài)學、生長特性、細胞周期及免疫表型。1材料和辦法11重要儀器和試劑離心機（BeckmanCoulterX-15R），75T培養(yǎng)瓶（CorningIncorporated），倒置顯微鏡（OLYMPUSCKX41），孵箱（ThermoCO2孵箱3111），流式細胞儀（BDFACSCalibur），DMEM/F12、膠原酶Ⅱ、025%胰酶（GIBCO），PE標記的CD34、CD45、CD73、CD105、FITC標記的HLA-ABC、HLA-DR（BDParmingen）。具體見表1。12人臍帶MSCs的分離、培養(yǎng)及擴增無菌采集健康胎兒臍帶15根，各取15cm隨機分為15組，再將每組臍帶平均分為3等份，用加有雙抗的生理鹽水充足清洗，去除臍靜脈及動脈內的殘留血液，將其剪碎成1mm3的組織塊，移至質量體積分數(shù)為10%的膠原酶Ⅱ中，37℃分別消化3h、5h、7h，200目濾網(wǎng)過濾，收集含細胞的濾液，4℃、r/min離心5min，棄上清，保存沉淀，用DMEM/F12將細胞輕輕吹打成單細胞懸液，充足洗滌，4℃、300r/min離心5min，棄上清，保存細胞沉淀，用體積分數(shù)為12%FBS的DMEM/F12重懸，制成單細胞懸液，胎盼藍計數(shù)法計活細胞數(shù)后，接種于25T培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的飽和濕度孵箱內培養(yǎng)。5～6d后初次全量換液，去除未貼壁細胞，后來每隔3～4d換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞達85%以上融合后，用質量體積分數(shù)為025%的胰酶消化細胞，倒置顯微鏡下控制消化時間，按1∶[KG-*3/5]3的比例傳代，繼續(xù)擴增培養(yǎng)。13細胞生長活性測定取第三代間充質干細胞，用025%胰酶消化后，以2×104/ml，接種于24孔板內，每隔24h消化3個孔，收集細胞，并用臺盼藍計數(shù)法計數(shù)，繪制生長曲線。14人臍帶MSCs的免疫表型鑒定取第三代細胞，以025%胰酶消化后，用含12%FBS的DMEM/F12終止消化，4℃、250r/min離心5min，去上清，制成2ml懸液，分為每管10μl。陰性對照管分別加入IgG-FITC、IgG-PE，其它管分別加入CD73-PE、CD105-PE、HLA-ABC-FITC，CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-FITC，室溫避光孵育30min，流式細胞儀檢測。15重要觀察指標①不同消化時間收獲人臍帶間充質干細胞數(shù)量。②人臍帶間充質干細胞生物學特性。16設計、實施、評定者設計、實施為第一作者，評定為第二作者，均通過系統(tǒng)培訓，未使用盲法評定。2成果21不同消化時間膠原酶Ⅱ對人臍帶間充質干細胞分離的影響參考王娟等[9]在人臍帶間充質干細胞體外分離、純化及鑒定中的辦法，通過比較臍帶的不同消化時間發(fā)現(xiàn)，全部標本中消化時間為3h時，未獲得間充質干細胞；消化時長為7h時，僅有少量細胞貼壁，但培養(yǎng)后無細胞融合；消化時長為5h時，倒置顯微鏡下觀察有大量活性細胞存在，且含有較強的增殖能力，見表2。22人臍帶MSCs分離、擴增及形態(tài)觀察本實驗通過對消化時長為5h的細胞培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，細胞多于24h內開始貼壁，培養(yǎng)7d后，大部分細胞貼壁，細胞呈梭形、多角形，14d后細胞生長較快，于14～21d即可達成85%融合。傳代后細胞生長速度明顯加緊，4～5d可傳代一次，傳代后細胞純度提高，形態(tài)為較為均一的梭形，以平行排列生長或旋渦狀生長。（圖1）23人臍帶MSCs的生長活性測定取第3代細胞繪制生長曲線，從曲線上能夠看出傳代后的細胞第1～2d處在滯留期，增殖不明顯。第3～5d進入對數(shù)生長久，細胞增殖加速，第6～7d進入平臺期（圖2）。24人臍帶MSCs的免疫表型分析經流式細胞術檢測，通過膠原酶消化法所獲得的細胞均體現(xiàn)CD73、CD105、HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45、HLA-DR，由此闡明，從臍帶分離出來的貼壁細胞即為間充質干細胞（圖3）。3討論臍帶內含兩條動脈和一條靜脈，血管的周邊圍繞著半透明的基質，稱為華通膠。以往資料顯示，可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、華通膠以及血管周邊組織等分離得到MSCs[10-14]。間充質干細胞（MSCs）含有自我復制、多向分化和免疫調控能力，在組織工程、基因工程和造血干細胞移植領域含有較好的應用前景。骨髓是現(xiàn)在MSCs的重要來源[15]，本實驗成果顯示臍帶來源的MSC與骨髓MSC的形態(tài)特點相似，并有更強的增殖能力[16]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)臍帶來源的MSC與骨髓來源的MSC表面抗原體現(xiàn)相近，表明該細胞體系中富含MSC。然而由于其細胞數(shù)量和增殖分化能力隨年紀增加而明顯下降，移植物不便在體外預先定制，異體移植中的倫理爭議以及病毒傳染等問題也限制了其臨床應用[17-18]。有實驗證明在不同的誘導條件下，MSCs不僅可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌肉細胞等中胚層細胞，并且還能夠跨胚層分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞等[19-23]。MSCs還對造血干細胞含有擴增作用，移植MSCs能夠增進造血干細胞的植入[24-25]。MSCs的分離辦法有：①貼壁篩選法：根據(jù)MSCs易貼附在塑料培養(yǎng)物上生長的特性將其與非貼壁細胞分離；有學者直接使用貼壁篩選法，但標本中的大量紅細胞占據(jù)了MSCs所需的貼壁空間，影響MSCs的獲得率[26]；②酶消化法：用膠原酶對臍帶組織進行消化，所獲得的細胞進行貼壁培養(yǎng)、擴增；③單細胞克隆的辦法[27]分離MSCs：實驗條件規(guī)定高，所需標本量大。現(xiàn)在已有學者[28]采用了將密度梯度離心法與貼壁相結合的方式進行分離，并獲得了較好的效果。本研究采用膠原酶Ⅱ消化法，通過比較不同的消化時間，從足月胎兒臍帶中分離、擴增出MSCs，并發(fā)現(xiàn)5h為最佳消化時間。從形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)MSCs，傳3～4代后細胞形態(tài)均一，貼壁后呈平行排列生長或旋渦狀生長。通過研究MSCs生長曲線圖發(fā)現(xiàn)，貼壁培養(yǎng)3～5d細胞處在對數(shù)生長久，細胞增殖速度快。對細胞生長周期研究發(fā)現(xiàn)，80%以上的細胞處在G0/G1期，S期占43%，G2期占102%，這闡明大部分細胞處在靜止狀態(tài)，但仍保存自我更新和增殖能力，這符合干細胞的特性。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，MSCs均體現(xiàn)CD73、CD105和HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45和免疫有關表型HLA-DR，HLA-DR是引發(fā)免疫排斥反映的重要因素，闡明臍帶MSCs可能是免疫原性相對較弱的一類細胞，這和骨髓源的MSCs含有相似的形態(tài)和免疫表型[29]，與國際定義的MSCs原則相一致[30]。有報道稱，骨髓MSCs高體現(xiàn)CD106[31]，推測低體現(xiàn)CD106有可能是外周來源MSCs與骨髓來源MSCs的鑒別點之一?？傊緦嶒瀼娜四殠е邢蛛x得到大量的MSCs，且最佳消化時間為5h，體外易于培養(yǎng)擴增，增殖能力強，臍帶MSCs病毒感染機會小，對供者和患者無不良影響，因此有望成為組織工程研究的種子細胞和臨床應用良好的間充質干細胞來源。參考文獻[1]SalamonA，ToldyE.Theroleofadultbonemarrowderivedmesenchymalstemcell，growthfactorsandcarriersinthetreatmentofcartilageandbonedefects[J].JStemCell，，4（1）：71-80.[2]李炳堯，武曉云，吳巖.間充質干細胞的分離與培養(yǎng)：從實驗室到臨床[J].中國組織工程研究，，17（14）：2649-2655.[3]FuS，ChengYC，LinMY，eta1.ConversionofhumanumbilicalmesenchymalstemcellsinWharton，sjellytodopaminergicneuronsinvitro-potentialtherapeuticapplicationforParkinsonism.[J].StemCells，，24：l15-124.[4]LaughlinMJ，BarkerJN，BambachB，etal.Hematopoieticengraftmentandsurvivalinadultrecipientsofumbilical-cordbloodfromunrelateddonors.NEngl[J].Med，，344（24）：1815-1822.[5]RochaV，CornishJ，SienersEL，etal.Comparisonofoutcomesofunrelatedbonemarrowandumbilicalcordbloodtransplantsinchildrenwithacuteleukemia[J].Blood，，97，（10）：2962-2971.[6]DominiciM，LeBlancK，MuellerI，etal.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement[J].Cytotherapy，，8（4）：315-317.[7]DaSilvaMeirellesL，CaplanAI，NardiNB.Insearchoftheinvivoidentityofmesenchymalstemcells[J].StemCells，，26（9）：2287-2299.[8]LiuL，ZhaoX，LiP，etal.AnovelwaytoisolateMSCsfromumbilicalcords[J].EurJImmunol，，42（8）：2190-2193.[9]王娟.人臍帶間充質干細胞體外分離、純化及鑒定[J].暨南大學學報（醫(yī)學版），，30（4）：367-372.[10]CovasDT，SiufiJL，SilvaAR，etal.IsolationandcultureofUmbilicalveinmesenchymalstemcells[J]BrazJMedBiolRes，，36：1179-1183.[11]SaugaserR，LickorishD，BakshD，etal.Humanumbilicalcordperivascularcells：asourseofmesenchymalprogenitors[J].StemCells，，23（2）：220-229.[12]KarahuseyinogluS，CinarO，KilicE，etal.Biologyofstemcellsinhumanumbilicalcordstroma：insituandinvitrosurveys[J].StemCells，，25（2）：319-331.[13]陳宇，張寧坤，楊明，等.臍帶華通膠間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].中國當代醫(yī)學雜志，，20（16）：2412-2415.[14]侯克東，盧世璧，張莉，等.人臍帶Wharton膠中間充質干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J].解放軍醫(yī)學雜志，，33（4）：375-378.[15]王恒湘，郭子寬.間充質干細胞在組織再生應用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志，，4（5）：241-245.[16]RahulS，DavidL，DoloresB，eta1.Humanumbilicalcordperivascular（HUCPV）cells：asourceofmesenchymalprogenitors[J].StemCells，，23（2）：220-229.[17]LavikE，LangerR.Tissueengineering：currentstateandperspectives[J].ApplMicrobiolBiotechnol，，65（1）：1-8.[18]蔣潔，譚燦，肖玲，等.臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其誘導分化[J].中國組織工程研究與臨床康復，，14（10），1734-1738.[19]FUYS，CHENGYC，LINMY，eta1.ConversionofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsinWharton，sjellytodopaminergicneuronsinvitro：potentialtherapeuticapplicationforParkinsonism[J].StemCells，，24（1）：115-124.[20]MarkL.Weiss，DerylL.Troyer.Stemcellsintheumbilicalcord[J].StemCellRev，，2（2）：155-162.[21]盧兆桐，李福泉.臍帶間充質干細胞分離培養(yǎng)及其定向分化研究[J].中華實驗外科雜志，，29（8）：1630.[22]哈承志，王大偉.臍帶間充質干細胞在骨組織工程中的應用進展[J].中國組織工程研究，，16（1）：158-162.[23]扈江偉，張顥，徐曼，等.臍帶全層源間充質干細胞分離培養(yǎng)及向成軟骨細胞分化的實驗研究[J].創(chuàng)傷外科雜志，，14（6）：531-534.[24]WangHS，HungSC，PengST，etal.MesenchymalstemcellsintheWharton’sjellyofthehumanumbilicalcord[J].StemCells，，22（7）：1330-1337.[25]SASAKIE，HANAZAWAK，KURITAR，etal.Establishmentofnovelembryonicstemcelllinesderivedfromthecommonmarmoset（Callithrixjacehus）[J].StemCells，