護(hù)肝片對中、晚期纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化增殖及nf-b及gf-1表達(dá)的影響

護(hù)肝片對中、晚期纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化增殖及nf-b及gf-1表達(dá)的影響

肝纖維是肝慢性損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)。這是慢性肝炎發(fā)展到肝硬化的必要階段。其主要特點(diǎn)是精細(xì)胞外基質(zhì)（em）的合成和分解失衡，導(dǎo)致em在子周圍空間的大量積聚。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells,HSC)是肝纖維化時ECM過多產(chǎn)生和沉積的主要細(xì)胞來源,HSC的激活、增殖及ECM的過量沉積在肝纖維化過程中起核心作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactorκB,NF-κB)是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì),普遍存在于多種組織的多種細(xì)胞中。體外研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可能參與調(diào)控了肝纖維化過程中的枯否氏細(xì)胞(Kupffercells,KC)和肝星狀細(xì)胞的活化。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-beta1,TGF-β1)是強(qiáng)有力的致纖維化的細(xì)胞因子,促進(jìn)HSC增殖活化,在纖維化進(jìn)程中起重要作用。護(hù)肝片抑制纖維化肝組織TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表達(dá),為此,本研究擬就護(hù)肝片對中晚期纖維化大鼠肝組織HSC與NF-κB、TGF-β1及TβRⅠmRNA表達(dá)的影響進(jìn)行觀察,進(jìn)一步探討其抗肝纖維化作用機(jī)制。材料和方法1.大鼠分組、模型組、護(hù)肝片組igSD大鼠54只,雌雄兼用,體重150-180g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物中心提供(清潔級),標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。隨機(jī)分成兩大組:模型復(fù)制8與13周,均各設(shè)正常組、模型組和護(hù)肝片(921mg/kg)組。自模型復(fù)制之日起,除正常組外,各組大鼠按100g體重0.5ml背部皮下注射10﹪CCl4精制花生油溶液,每周2次,分別連續(xù)8與13周。灌胃(ig)給藥,每天1次,正常組與模型組ig等容量5g/l羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,直至8周或13周。分別在實(shí)驗(yàn)的第8、13周末處死動物,取左葉肝組織常規(guī)10﹪甲醛溶液固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,HE染色,光鏡觀察。2.集目標(biāo)組織整合式組織芯片的制作HE染色切片在光鏡下用定位器定位后,通過打孔、定位、取樣、點(diǎn)樣,從供體蠟塊中的相應(yīng)部位采集目標(biāo)組織整齊包埋于受體蠟塊中,制成組織片直徑為1mm、間隔1mm的組織芯片。4μm連續(xù)切片,貼附于經(jīng)10﹪多聚賴氨酸防脫片預(yù)處理的載玻片上,分別作蘇木精-伊紅(HE)染色、網(wǎng)狀纖維染色、VanGieson(VG)膠原纖維染色、免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交。3.羊抗actin、兔抗nf-bp65的研究與試劑采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù),S-P法免疫組織化學(xué)染色,用DAB/H202顯色,蘇木精復(fù)染。羊抗Actin(Ⅰ-19)、兔抗NF-κBp65多克隆抗體均購于SantaCruz,兔S-P法(SecondGenerationLAB-SA)Kits試劑盒為美國Zymed公司產(chǎn)品。具體操作遵試劑盒說明書,用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。4.tr靶基因的檢測TGF-β1及TβRⅠ的寡核苷酸探針均經(jīng)地高辛標(biāo)記,顯色系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(SABC),DAB顯色。針對TGF-β1靶基因的mRNA的探針序列為:(1)5′-ACCTGCAAGACTATCGACATGGAGCTGGTG-3′;(2)5′-TGTACAACAGCACCCGCGACCGGGTGGCCG-3′;(3)5′-GTACCAGAAATACAGCAACAATTCCTGGCG-3′。針對TβRⅠ靶基因的mRNA的探針序列為:(1)5′-TAGCTGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATA-3′;(2)5′-GTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTT-3′;(3)5′-GTATGCCAATGGAGCAGCTAGGCTTACAGC-3′。TGF-β1及TβRⅠ的原位雜交檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。具體操作遵試劑盒說明書,用已知陽性切片作為陽性對照,用預(yù)雜交液代替雜交液作陰性對照。5.原位雜交染色結(jié)果肝纖維化病理學(xué)分級為0-Ⅵ級。α-SMA免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性,200倍光鏡下任選3個250μm×250μm范圍計(jì)數(shù)α-SMA陽性細(xì)胞來判斷結(jié)果。NF-κB以細(xì)胞漿和∕或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性;TGF-β1及TβRⅠmRNA的原位雜交染色結(jié)果,以胞漿內(nèi)或胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。EclipseE800型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)(×400)下任選取3個視野用SpotAdvanced顯微攝像系統(tǒng)(美國DiagnosticInstrumentsInc)拍攝照片,用4.01版MetaMorph圖像分析系統(tǒng)(美國UniversalImaging公司)進(jìn)行顯微定量分析,分析每個組織片上NF-κB蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的平均灰度值(Averagegrayvalue,AGV)和平均光密度值(Meanopticaldensity,MOD)。6.統(tǒng)計(jì)處理運(yùn)用SPSS(11.0forwindows)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料間比較采用t檢驗(yàn)和onewayANOVA檢驗(yàn)。ccl4所致纖維化大鼠肝組織-sma的表達(dá)情況1.護(hù)肝片對CCl4性纖維化大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響HE、網(wǎng)狀纖維及VG膠原纖維染色結(jié)果見表1。正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無炎細(xì)胞浸潤,模型組大鼠在模型復(fù)制8、13周均可見肝細(xì)胞脂肪變性、水變性和點(diǎn)狀壞死、碎片狀壞死,13周時膠原纖維增生形成完整的纖維間隔,并分割肝小葉形成假小葉,纖維間隔內(nèi)可見慢性炎細(xì)胞浸潤。在模型復(fù)制8、13周,護(hù)肝片組肝細(xì)胞的水變性、脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生均輕于模型組。模型復(fù)制8、13周,正常組與模型組肝纖維化分級比較,差異有顯著性(P<0.01)。2.α-SMA陽性細(xì)胞在正常及纖維化大鼠肝組織中的分布及護(hù)肝片對其數(shù)量的影響HE染色結(jié)合免疫組化染色結(jié)果觀察顯示,α-SMA陽性細(xì)胞位于竇周Disse間隙,形態(tài)不規(guī)則,胞體呈卵圓形或不規(guī)則。正常組、模型組及護(hù)肝片組肝組織中均有α-SMA陽性細(xì)胞,但其數(shù)量明顯的不同(表2)。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常組,且模型組的α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)8周明顯高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,護(hù)肝片組肝組織α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著低于模型組。3.NF-κBp65蛋白在CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護(hù)肝片對其表達(dá)的影響正常對照組大鼠肝組織較少表達(dá)NF-κBp65蛋白(圖1,圖4),模型組大鼠肝組織則有較強(qiáng)的NF-κBp65蛋白表達(dá),分布在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中(圖2,圖5)。NF-κBp65蛋白的陽性染色分布于纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞,脂肪變性和水變性表2護(hù)肝片對CCl4所致纖維化大鼠肝組織α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量的影響(單位:個)的肝細(xì)胞也可見陽性染色。表3顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,模型組肝組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)量顯著高于正常組。模型組肝組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)量8、13周相比差異無顯著性。大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,護(hù)肝片(圖3,圖6)顯著地抑制纖維化肝組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)(P<0.01)。4.TGF-β1及TβRⅠ的mRNA在CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護(hù)肝片對其的影響正常肝組織不表達(dá)或僅微弱表達(dá)TGF-β1及TβRⅠmRNA,它們分布于胞質(zhì)和∕或胞核內(nèi)(圖7,圖10,圖13,圖16);模型組(圖8,圖11,圖14,圖17)和護(hù)肝片(圖9,圖12,圖15,圖18)組肝組織均有較強(qiáng)的TGF-β1及TβRⅠmRNA表達(dá),主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核上。TGF-β1及TβRⅠmRNA的陽性染色分布于變性的肝細(xì)胞、纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞。表4顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組肝組織TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著高于正常組。模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,護(hù)肝片組肝組織TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著低于模型組,但仍顯著高于正常組。5.相關(guān)分析表5顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周,正常組、模型組及護(hù)肝片組大鼠肝組織的α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)、NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA表達(dá)量相互間均呈顯著正相關(guān)。大鼠CCl4性肝纖維化13周,除α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)與TβRⅠmRNA表達(dá)量之間不相關(guān)之外,其余各數(shù)據(jù)之間均呈顯著正相關(guān)。肝纖維化中hsc的表達(dá)及變化中藥護(hù)肝片(黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)是糖衣片,由柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子、豬膽粉、綠豆組成,有抗肝纖維化作用。本模型采用12.5%CCl4致大鼠肝纖維化的一般病理學(xué)改變結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞消失,匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)膠原纖維增生,分割肝小葉形成大方形及小方形假小葉,模型組的肝損傷及其纖維化分級均顯著高于正常組,表明CCl4致大鼠肝纖維化造模成功。8、13周模型組肝損傷的病理組織學(xué)變化及纖維化分級間無明顯差異,但13周較8周有發(fā)展加重趨勢,這與8周肝纖維化已經(jīng)形成,而晚期(13周)肝纖維化可能處于相對穩(wěn)定狀態(tài)、膠原的合成與降解達(dá)到新的平衡有關(guān)。護(hù)肝片組的肝損傷及其纖維化分級均輕于模型組,進(jìn)一步證實(shí)護(hù)肝片對大鼠CCl4慢性肝損傷及其纖維化形成有抑制作用。肝纖維化是肝臟對各種損傷的修復(fù)反應(yīng),在肝臟炎癥損傷過程申,HSC活化發(fā)生表型轉(zhuǎn)變而具有肌成纖維細(xì)胞(MFB)的特性,使ECM-膠原蛋白合成增加,細(xì)胞收縮性增強(qiáng),在肝纖維化的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,HSC活化是肝纖維化形成過程的中心環(huán)節(jié),α-SMA是其活化的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)用12.5%CCl4致大鼠慢性肝損傷,α-SMA染色結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織活化的HSC(即α-SMA陽性細(xì)胞)數(shù)量均較正常組顯著增多,這與文獻(xiàn)報道一致。證實(shí)在肝纖維化過程中活化的HSC數(shù)量增多,即HSC被活化并大量增殖。在大鼠CCl4性肝纖維化8、13周時,模型組有明顯的肝纖維化形成,表明HSC的活化、增殖與ECM的沉積的現(xiàn)象是一致的,兩者關(guān)系密切。本次實(shí)驗(yàn)中,出現(xiàn)13周模型組活化的HSC數(shù)量較8周顯著減少這一有趣的現(xiàn)象,對這一現(xiàn)象的解釋目前尚無文獻(xiàn)報道,我們推測可能是由于晚期肝纖維化已處于相對穩(wěn)定狀態(tài),膠原的合成與降解處新的平衡所致,有待于進(jìn)一步研究。大鼠CCl4性肝纖維化8周,活化的HSC數(shù)量與NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)均呈顯著正相關(guān);13周活化的HSC數(shù)量也與NF-κBp65蛋白、TGF-β1mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān);8、13周,護(hù)肝片組肝組織活化的HSC數(shù)量均較模型組顯著減少,提示:①肝纖維化時HSC的活化、增殖與NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)有關(guān);②護(hù)肝片的抗肝纖維化作用機(jī)制之一可能是抑制纖維化肝組織HSC的活化與增殖。目前共克隆得到5種TGF-β異構(gòu)體,命名為TGF-β1-5,在哺乳動物僅有TGF-β1-3。在肝臟TGF-β1是各種TGF-β異構(gòu)體中最主要的存在形式,TGF-β1含量較TGF-β2、TGF-β3高約10倍,TGF-β1是強(qiáng)有力的致纖維化的細(xì)胞因子,在肝纖維化時表達(dá)明顯增多,促進(jìn)HSC增殖活化,合成大量ECM,在纖維化進(jìn)程中起重要作用。TGF-β1是肝纖維化主要的始動因子之一,研究證實(shí)肝纖維化時其表達(dá)增加。TGF-β產(chǎn)生時均以非活性狀態(tài)存在,與相應(yīng)受體無結(jié)合活性。肝受損時,肝內(nèi)的炎癥細(xì)胞、HSC、KC等自分泌或旁分泌非活性TGF-β1,非活性TGF-β1被炎癥環(huán)境中的各種酶和細(xì)胞因子激活,刺激上述細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生TGF-β1,形成逐級放大效應(yīng),導(dǎo)致TGF-β1大量生成和激活?；钚訲GF-β1通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β以自分泌和旁分泌方式參與HSC的活化,促進(jìn)HSC合成各種膠原成分以及組織金屬蛋白抑制劑(TIMPs),同時能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(NMPs)的合成,引起ECM積聚而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。研究表明護(hù)肝片抑制纖維化大鼠肝組織TGF-β1及TβRⅠ的蛋白的表達(dá),試驗(yàn)結(jié)果顯示,在CCl4性大鼠肝纖維化中晚期,肝組織中TGF-β1及TβRⅠ的mRNA的表達(dá)均呈明顯一致性增多,表明在肝纖維化過程中,TGF-β1及TβRⅠ表達(dá)增加是由于其轉(zhuǎn)錄水平增加所致,且TGF-β1與TβRⅠ在肝纖維化過程中有協(xié)同作用,在中晚期肝纖維化中起重要作用;模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周,護(hù)肝片在mRNA水平上抑制中晚期纖維化肝組織TGF-β1及TβRⅠ的表達(dá),提示在肝纖維化不同時期,上述靶點(diǎn)的反應(yīng)性有所差異,可能受到多種因素的影響,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究;抑制TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)是護(hù)肝片抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。TGF-β1的合成受核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,目前發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子主要有NF-κB、AP-1等。NF-κB在哺乳動物中最多見的是由p65和p50組成的異源二聚體。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時,NF-κB位于細(xì)胞質(zhì),其p65亞基與抑制蛋白(InhibitorykappaB,IκB)單體結(jié)合,覆蓋p50的核定位信號,使NF-κB與IκB以三聚體失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激時,IκB發(fā)生磷酸化,并從NF-κB二聚體上解離,暴露p50的核定位信號,NF-κB得以激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1活化因子組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶(tTG)基因的啟動子中含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn),因而NF-κB能促進(jìn)TGF-β1表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組相比,8、13周模型組大鼠肝臟組織NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),而且8、13周NF-κBp65蛋白與TGF-β1及TβRⅠmRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示NF-κB參與肝纖維化反應(yīng),促進(jìn)肝纖維化形成;肝纖維化過程中,N