第十六節(jié)血紅蛋白的提取及分離一

血紅蛋白的提取和分離（一）主講：黃岡中學(xué)優(yōu)秀生物教師王小敏★課題目的1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白；2、理解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理?！镎n題重點(diǎn)凝膠色譜法的原理和辦法。★課題難點(diǎn)樣品的預(yù)解決；色譜柱填料的解決和色譜柱的裝填。一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）蛋白質(zhì)提取和分離的原理根據(jù)蛋白質(zhì)多個(gè)特性的差別，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其它分子的親和力等等，能夠用來分離不同蛋白質(zhì)。（二）凝膠色譜法（分派色譜法）1、概念：根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，運(yùn)用品有網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠，來進(jìn)行分離的辦法。2、原理：大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。3、凝膠材料：微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道。4、分離過程：洗脫：從色譜柱上端不停注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。（三）緩沖溶液1、作用：能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH值的影響，維持pH基本不變。2、緩沖溶液的配制：由弱酸和對(duì)應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是pH=7.0的磷酸緩沖液，目的是運(yùn)用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，確保血紅蛋白的正常構(gòu)造和功效，便于觀察紅色和材料的科學(xué)研究活性。（四）電泳1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2、原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，造成不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素決定運(yùn)動(dòng)方向電場作用力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)√電荷量√√分子形狀√√分子大小√√3、慣用辦法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳：（1）在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)慣用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠：由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的含有三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠。（2）原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少及分子的大小等因素。加入SDS可消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（3）SDS作用機(jī)理：SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測定的成果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與多個(gè)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超出了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。（4）用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的辦法使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的原則蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的原則蛋白的電泳區(qū)帶位置，能夠測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的原則蛋白試劑出售。電泳檢測成果：（五）血紅蛋白在紅細(xì)胞的構(gòu)成中，約90%是血紅蛋白。它由四個(gè)肽鏈構(gòu)成，涉及兩個(gè)α—肽鏈和兩個(gè)β—肽鏈。每條肽鏈圍繞一種亞鐵血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。

-返回-同時(shí)測試一、選擇題1、凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是（）A．變化蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)的途徑B．吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度C．將酶或紐胞固定在凝膠中D．與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反映，從而影響其移動(dòng)速度2、運(yùn)用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來（）A．相對(duì)分子質(zhì)量大的B．溶解度高的C．相對(duì)分子量小的D．所代電荷多的3、緩沖液的作用是：在一定范疇內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A．溫度B．pHC．滲入壓D．氧氣濃度4、電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。A．相似B．相反C．相對(duì)D．相向

AABB-END-課外拓展凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面的，其中儀器、填料、聯(lián)用技術(shù)、色譜理論等方面的進(jìn)展是和整個(gè)液體色譜的進(jìn)展有關(guān)的。但是下面四個(gè)研究動(dòng)向意義較大，值得注意。凝膠色譜法分析儀器通過與其它儀器聯(lián)用，解決凝膠色譜法測定高聚物分子量分布從相對(duì)法向絕對(duì)法過渡。測定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應(yīng)用。試樣先根據(jù)分子體積（即分子量）分離后再檢測各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中進(jìn)行的，被分離后的組分在流出柱子時(shí)就同時(shí)持續(xù)地用濃度檢測器和分子量檢測器分別檢側(cè)各組分的濃度和分子量，把兩個(gè)檢測器的輸出訊號(hào)用統(tǒng)計(jì)儀統(tǒng)計(jì)后即得反映分子量分布的凝膠色譜曲線。過去由于沒有比較敏捷和瞬時(shí)響應(yīng)的分子量檢測器，因而運(yùn)用一組不同分子量的標(biāo)樣來標(biāo)定色譜柱，然后從分子量算出體積的標(biāo)定曲線來作數(shù)據(jù)換算。這種用相對(duì)辦法來檢測分子量即使臨時(shí)解決了問題，但是隨之而來的是實(shí)驗(yàn)工作量增加以及數(shù)據(jù)解決辦法上存在困難。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性在很大程度上決定于標(biāo)定曲線、標(biāo)樣分子量數(shù)值以及數(shù)據(jù)解決辦法的可靠性。其中色譜柱分離效率不抱負(fù)所引發(fā)的色譜峰加寬效應(yīng)的改正，不僅實(shí)驗(yàn)辦法比較煩瑣，并且數(shù)據(jù)解決也比較復(fù)雜，需要用電子計(jì)算機(jī)來計(jì)算。因此即使文獻(xiàn)中已經(jīng)推薦許多據(jù)說是比較滿意的計(jì)算辦法，但這總不是一種根本解決的辦法。只有真正找到絕對(duì)分子量檢測器，問題才算較好解決。原有的許多分子量測定辦法，由于不能做到足夠敏捷的瞬時(shí)響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上應(yīng)用。凝膠色譜柱近來Ouano用激光小角光散射儀（LALLS）來作分子量檢測器得到比較好的成果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不需要標(biāo)定曲線，也不必進(jìn)行峰加寬改正。由于激光的準(zhǔn)直性較好，強(qiáng)度較大，能夠允許在較小的角度下測量較稀溶液的散射光強(qiáng)，由此能夠直接計(jì)算出平均分子量的近似值而不需要象典型光散射那樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還要對(duì)濃度和散射角度向零作雙外推。實(shí)驗(yàn)上，凝膠色譜儀和激光小角光散射儀聯(lián)用后，還可與計(jì)算機(jī)直接聯(lián)接進(jìn)行數(shù)據(jù)解決。在一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完畢后，所需要的數(shù)據(jù)可全部立刻獲得。GPC-LALLS似乎得到更合理的數(shù)值。激光小角散射儀已開始商品化，預(yù)計(jì)很快將會(huì)有更多的研究工作，來闡明已經(jīng)在何種程度上解決了凝膠色譜的相對(duì)測定過渡到絕對(duì)測定。凝膠色譜中的濃度檢測器和普通的液體色譜同樣仍然是一種單薄環(huán)節(jié)，繼續(xù)在尋找更抱負(fù)的檢測器。現(xiàn)在最慣用的仍然是示差折光檢測器和紫外檢測器。

-END-高考解析例、下列對(duì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)的敘述，不對(duì)的的是（）A．血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中使用的交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75，其中“75”表達(dá)每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克B．在色素的提取和分離的實(shí)驗(yàn)中，葉綠素b在層析液中的