真菌的遺傳分析課件

真核生物特殊染色體作圖真菌的染色體作圖酵母的無(wú)序四分體分析真菌廣泛分布于全球各帶的土壤、水體、動(dòng)植物及其殘骸和空氣中，營(yíng)腐生、寄生和共生生活。自林奈把生物區(qū)分為動(dòng)物和植物兩界以后的200多年以來(lái)，真菌因固著生活和細(xì)胞具有細(xì)胞壁而一直被歸入植物界。從20世紀(jì)中葉起，生物學(xué)家認(rèn)為真菌的起源、組織、營(yíng)養(yǎng)方式和細(xì)胞壁的組分等都與植物不同，把它歸入植物界并不妥當(dāng)。真菌營(yíng)養(yǎng)方式是“吸收異養(yǎng)型〞，主要作用是分解,它與植物的光合自養(yǎng)和動(dòng)物的攝食異養(yǎng),都有著本質(zhì)的區(qū)別。所以,在近20～30年的4界以上分類系統(tǒng)中，大多將真菌獨(dú)立成界。真菌的染色體作圖一、真菌的相關(guān)背景腳氣頭癬灰指甲真菌與人類的關(guān)系真菌的繁殖方式包括無(wú)性生殖、有性生殖；無(wú)性生殖:是指不經(jīng)過(guò)兩性細(xì)胞的結(jié)合便產(chǎn)生新的個(gè)體。生殖方法有：①體細(xì)胞〔菌絲〕的斷裂；②體細(xì)胞分裂成子細(xì)胞；③體細(xì)胞或孢子的芽殖；④各種無(wú)性孢子〔如游動(dòng)孢子、孢囊孢子、分生孢子、厚垣孢子等〕的產(chǎn)生，每個(gè)孢子可萌生芽管，再形成菌絲體。無(wú)性生殖在真菌的繁衍和傳播上起重要作用。有性生殖:有游動(dòng)配子配合、配子囊接觸交配、配子囊交配、性孢子配合和體細(xì)胞配合等形式。真菌的生殖鏈孢霉的野生型又稱為原養(yǎng)型〔prototroph〕，在根本培養(yǎng)基上就能生長(zhǎng)，子囊孢子按時(shí)成熟呈黑色。鏈孢霉的營(yíng)養(yǎng)缺陷型〔auxotroph〕，有一類突變型是不能合成某些物質(zhì)，在根本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，只能在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如賴氨酸缺陷型是自己不能合成賴氨酸，因此培養(yǎng)時(shí)必須在根本培養(yǎng)基上參加適量的賴氨酸，此種缺陷型才能生長(zhǎng)。缺陷型比野生型的子囊孢子成熟得慢，所以鏡檢時(shí)突變型的子囊孢子呈白色，和黑色的野生型子囊孢子很容易分辨在同源染色體上如果有一對(duì)等位基因A和a，如果交換發(fā)生在A和著絲點(diǎn)之外，那么在第一次減數(shù)分裂時(shí)A和a就完全分開(kāi)進(jìn)入不同的兩極，至于各向哪一極移動(dòng)是隨機(jī)的，但一旦確定就決定了以后子囊孢子排列的位置。第二次減數(shù)分裂時(shí)，染色單體各自分開(kāi)，分別進(jìn)入4個(gè)孢子，進(jìn)一步有絲分裂形成了8個(gè)子囊孢子，野生型為黑色，營(yíng)養(yǎng)缺陷型為白色，4黑4白有序排列，這種類型說(shuō)明在A和著絲點(diǎn)之間未發(fā)生交換，或沒(méi)有有效的交換。此稱為第一次分裂別離〔firstdivisionsegregation〕。假設(shè)在A基因和著絲點(diǎn)之間發(fā)生了一次交換，那么第一次減數(shù)分裂時(shí)，一對(duì)同源染色體的兩條姊妹染色單體攜帶了A和a，進(jìn)入同一個(gè)子細(xì)胞，A和a沒(méi)有別離，同樣它們趨向兩極時(shí)是隨機(jī)的，直到第二次減數(shù)分裂形成四分子時(shí)，著絲粒也分開(kāi)，A和a才分開(kāi)，各自進(jìn)入一個(gè)子囊孢子中，故稱為第二次分裂別離〔seconddivisionsegregation〕。第二次分裂時(shí)A和a趨向哪一級(jí)也是隨機(jī)的，一旦確定就決定了最后的8個(gè)子囊孢子的排列方式。由于第一次和第二次減數(shù)分裂的隨機(jī)性，最后8個(gè)子囊孢子的排列有幾種不同的組合，但決不會(huì)是4黑4白，總是兩兩相間。第二次別離說(shuō)明在標(biāo)記基因和著絲粒之間發(fā)生了一次交換。第一次別離和第二次別離的模式圖第一次分裂別離:＋＋－－第二次分裂別離:＋＋－－＋－＋－＋－－＋－＋＋－－＋－＋著絲粒作圖〔centromeremapping〕就是利用分裂別離來(lái)確定是否重組，再來(lái)計(jì)算標(biāo)記基因到著絲點(diǎn)之間的圖距。重組率=(交換型子囊數(shù)/總子囊數(shù))×1/2×100％這一公式和真核生物的重組率的計(jì)算原理相同，都是計(jì)算重組型占后代總數(shù)的比。因?yàn)槲覀兘y(tǒng)計(jì)的單位不是子囊孢子，而是一個(gè)子囊中含有8個(gè)子囊孢子，它們來(lái)自四條染色單體，即使是重組型的子囊里面含的四條染色單體中也只有兩條發(fā)生了交換，還有兩條未發(fā)生交換，所以必須乘以1/2。三、鏈孢霉的連鎖作圖

（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）四分體基因型＋

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+分裂分離M=1\*ROMANI

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M=2\*ROMANII子囊類型（PD）（NPD）（T）（T）（PD）（NPD）（T）子囊數(shù)80819059015染色體交換根據(jù)著絲粒作圖公式可算出各標(biāo)記與著絲粒之間的圖距。著絲粒與nic座位之間的圖距可通過(guò)各種子囊型中重組型的子囊數(shù)來(lái)計(jì)算，根據(jù)表，只有第4，5，6，7型子囊在nic和著絲粒之間才存在MII，即發(fā)生交換重組，所以RF〔著絲粒-nic〕=[(4)(5)(6)(7)/1000]51/25100%=[(5+90+1+5)/1000]×1/2=5.05%=5.05(m.u)同理RF〔著絲粒-ad〕=[(3)(5)(6)(7)/1000]51/25100%=[(90+90+1+5)/1000]×1/2=9.30%=9.30(m.u)計(jì)算的結(jié)果告訴我們nic和著絲點(diǎn)之間的距離為5.05圖距單位〔m.u.〕。ad和著絲點(diǎn)之間的9.30(m.u)目前知道了nic和ad是在同一條染色體上以及它們和著絲點(diǎn)的距離，排除以下圖的第一種可能；但還不知道具體的順序排列。因根據(jù)目前的信息有兩種可能：〔1〕nic和ad分別位于著絲點(diǎn)的兩側(cè)；〔2〕nic和ad位于著絲粒的同側(cè)假設(shè)兩個(gè)位點(diǎn)在著絲點(diǎn)的兩側(cè)，那么nic和著絲點(diǎn)之間的重組與ad和著絲點(diǎn)之間的重組上各自獨(dú)立的，也就是說(shuō)nic和著絲點(diǎn)之間發(fā)生一次重組不會(huì)影響到ad和著絲點(diǎn)之間的關(guān)系；相反，假設(shè)兩個(gè)座位都在著絲點(diǎn)的同側(cè)，一旦nic和著絲點(diǎn)之間發(fā)生了一次交換，假設(shè)不存在雙交換的話，勢(shì)必使ad和著絲粒也產(chǎn)生重組。從前面的資料來(lái)看，nic和著絲粒之間產(chǎn)生的子囊為〔4〕〔5〕〔6〕〔7〕，共101個(gè)子囊，其中〔5〕〔6〕〔7〕型子囊共96個(gè)同時(shí)也發(fā)生了ad和著絲粒之間的重組，說(shuō)明根本是符合第二種情況，那么為什么有五次不同步發(fā)生重組呢？從表中不難看出，不同步的僅為第四種子囊型，兩個(gè)座位分別為MII、MI，共5個(gè)子囊，從重組的圖中很清楚地看到是由于在nic和ad之間發(fā)生了一次雙交換，結(jié)果使ad和著絲粒之間未能重組。1、鏈孢霉后代多，樣本大，統(tǒng)計(jì)分析的誤差??；2、生活周期段短，在短時(shí)間內(nèi)可獲得結(jié)果。3、鏈孢霉易培養(yǎng)和操作，可利用選擇培養(yǎng)基篩選各種突變型；4、子囊孢子是單倍體，不存在顯隱性的問(wèn)題，表型和基因型一致；5、鏈孢霉又屬真核生物，可作為真核的研究模型，因此是很好的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料。鏈孢霉用于遺傳分析的優(yōu)點(diǎn)酵母的無(wú)序四分子分析一、無(wú)序四分子有些真核生物產(chǎn)生的孢子不像鏈孢霉產(chǎn)生有序的排列孢子，這種沒(méi)有特殊順序四分子或者八孢子的遺傳重組分析過(guò)程，就是無(wú)序四分子分析。酵母的有性生殖例如：現(xiàn)在假設(shè)酵母有兩基因位點(diǎn)a和b，我們想確定它們是否連鎖，如果連鎖還要計(jì)算ab之間的圖距。處在兩條染色體上的遺傳圖示當(dāng)兩個(gè)基因a、b在不同染色體上時(shí)，PD和NPD的四分體不是因?yàn)榻粨Q而產(chǎn)生，而是由于在減數(shù)分裂中期染色體的不同排列所造成的。由于四條染色體在中期板上排列的狀態(tài)是獨(dú)立的，一對(duì)同源染色體分別向兩極的移動(dòng)是隨機(jī)的，所以PD和NPD型的四分子的頻率相等，NPD應(yīng)占50％如果兩個(gè)基因連鎖，各種四分體的類型如以下圖所示，假設(shè)未發(fā)生交換，產(chǎn)生親二型〔PD〕，如在兩個(gè)基因間發(fā)生一次交換，結(jié)果產(chǎn)生兩個(gè)親組合和兩個(gè)重組合的染色體稱為四型〔T〕。假設(shè)發(fā)生雙交換的話，仍是親二型〔PD〕；假設(shè)發(fā)生三鏈交換的話，那么涉及到四條染色體中的三條，有兩種形式：1－3三鏈雙交換和2－4三鏈雙交換，其結(jié)果是產(chǎn)生四型的子囊，即兩條染色體是重組的，兩條染色體是親組合的。最后一種是四鏈雙交換，產(chǎn)生的子囊是NPD。NPD是4種雙交換中的一種，應(yīng)當(dāng)比較少。如以下圖所示

abPDABNCOababABABabaBAbABababABABaBabAbABabaBABAbaBaBAbAb

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abNPDABDCO連鎖遺傳的圖示如果PD的頻率遠(yuǎn)大于NPD子囊的頻率，即PD>>NPD，我們就可以推斷這兩個(gè)基因是連鎖的。一旦已確定兩個(gè)基因是連鎖的，只要具有各種類型子囊數(shù)據(jù)的資料，就可以根據(jù)作圖公式來(lái)計(jì)算兩個(gè)基因之間的距離分子標(biāo)記作圖分子標(biāo)記：是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為根底的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映；與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記統(tǒng)稱為遺傳標(biāo)記一、分子標(biāo)記的相關(guān)知識(shí)廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的、并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶〔指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式〕及等位酶〔指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式〕。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納。本文中也將分子標(biāo)記概念限定在DNA標(biāo)記范疇。形態(tài)標(biāo)記：指肉眼可見(jiàn)的或儀器測(cè)量動(dòng)物的外部特征(如毛色、體型、外形、皮膚結(jié)構(gòu)等)，以這種形態(tài)性狀、生理性狀及生態(tài)地理分布等待征為遺傳標(biāo)記，研究物種間的關(guān)系、分類和鑒定。形態(tài)學(xué)標(biāo)記研究物種是基于個(gè)體性狀描述，得到的結(jié)論不夠完善，且數(shù)量性狀很難剔除環(huán)境的影響，需生物統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)進(jìn)行嚴(yán)密的分析。但是用直觀的標(biāo)記研究質(zhì)量性狀的遺傳顯得更簡(jiǎn)單、更方便。目前此法仍是一種有效手段并發(fā)揮著重要作用。生物化學(xué)標(biāo)記：以動(dòng)物體內(nèi)的某些生化性狀為遺傳標(biāo)記，主要指血型、血清蛋白及同工酶。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)作為檢測(cè)遺傳特性的一種主要方法得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白電泳所檢測(cè)的主要是血漿和血細(xì)胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，通過(guò)對(duì)一系列蛋白和同工酶的檢測(cè)，就可為動(dòng)物品種內(nèi)的遺傳變異和品種間的親緣關(guān)系提供有用的信息。但是，蛋白和同工酶都是基因的表達(dá)產(chǎn)物，非遺傳物質(zhì)本身，它們的表現(xiàn)易受環(huán)境和發(fā)育狀況的影響；這些因素決定了蛋白電泳具有一定的局限性，但是蛋白電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速及檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較低，日前仍是遺傳特性研究中應(yīng)用較多的方法之一。細(xì)胞遺傳標(biāo)記：遺傳標(biāo)記的一種，指對(duì)處理過(guò)的動(dòng)物個(gè)體染色體數(shù)目和形態(tài)進(jìn)行分析，主要包括：染色體核型和帶型及缺失、重復(fù)、易位、倒位等。一個(gè)物種的核型特征即染色體數(shù)目、形態(tài)及行為的穩(wěn)定是相對(duì)的，故可作為一種遺傳標(biāo)記來(lái)測(cè)定基因所在的染色體及在染色體上的相對(duì)位置，染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者，染色體變異必然會(huì)導(dǎo)致生物體發(fā)生遺傳變異，是遺傳變異的重要來(lái)源。通過(guò)比較動(dòng)物與其近緣祖先的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，追溯動(dòng)物的起源和演化，檢測(cè)動(dòng)物的遺傳特性，為動(dòng)物育種提供較好的方法。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)以下幾個(gè)要求：具有高的多態(tài)性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3)能明確區(qū)分等位基因；(4)遍布整個(gè)基因組；除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組；(5)選擇中性(即無(wú)基因多效性)；(6)檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化)；(7)開(kāi)發(fā)本錢和使用本錢盡量低廉；(8)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿足以上所有要求。1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

RFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標(biāo)記。原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個(gè)體的DNA時(shí)，如果存在酶切位點(diǎn)的變化，就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測(cè)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)行為的改變。根本過(guò)程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影RFLP的等位基因其有共顯性特點(diǎn)。RFLP標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量不受限制，通常可檢測(cè)到的基因座位數(shù)為1—4個(gè)。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實(shí)驗(yàn)操作較繁鎖，檢測(cè)周期長(zhǎng)，本錢費(fèi)用也很高。自RFLP問(wèn)世以來(lái)，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。PCR—RFLP如果多態(tài)性位點(diǎn)周圍的DNA序列，那么可用PCR快速而簡(jiǎn)單地進(jìn)行RFLP分析。首先根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)和合成引物；以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行消化；再進(jìn)行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。2、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)

數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列又稱小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。VNTR根本原理與RFLP大致相同，只是對(duì)限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點(diǎn)，那么可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無(wú)關(guān)序列，通過(guò)電泳可充分顯示不同長(zhǎng)度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過(guò)分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測(cè)到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜。3、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)RAPD技術(shù)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術(shù)開(kāi)展的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法。根本原理：它是利用隨機(jī)引物〔一般為8—10bp〕通過(guò)PCR反響非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所使用的引物各不相同，但對(duì)任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測(cè)基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物那么可使檢測(cè)區(qū)域擴(kuò)大到整個(gè)基因組，因此，RAPD可用于對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。與RFLP相比，RAPD具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)技術(shù)簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快；(2)RAPD分析只需少量DNA樣品；(3)不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)，一套引物可用于不同生物基因組分析；(4)本錢較低。但RAPD也存在一些缺點(diǎn)：RAPD標(biāo)記是一個(gè)顯性標(biāo)記，不能鑒別雜合子和純合子；(2)存在共遷移問(wèn)題，凝膠電泳只能分開(kāi)不同長(zhǎng)度DNA片段，而不能分開(kāi)那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；(3)RAPD技術(shù)中影響因素很多，所以實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。4、任意引物PCR(ArbitrarilyPrimedPolymeraseChainReaction，AP—PCR)在AP—PCR分析中，所使用的引物較長(zhǎng)(10－50bp)，PCR反響分為兩個(gè)階段，首先寡核昔酸引物在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與模板DNA退火，此時(shí)發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)退火條件的循環(huán)，兩個(gè)位點(diǎn)間那些序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下擴(kuò)增。采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，最終反響結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計(jì)的引物在低嚴(yán)謹(jǐn)退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對(duì)組合的引物可以產(chǎn)生新的AP—PCR譜帶，但引物配對(duì)組合使用時(shí)，得到的圖譜與單引物單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的圖譜之和很不相同，這樣，50個(gè)引物能產(chǎn)生1250種不同指紋圖譜。AP—PCR方法不需預(yù)知序列資料，而且檢測(cè)的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測(cè)近等基因系(或同類系)中的多態(tài)性。AP—PCR的缺點(diǎn)是每個(gè)新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進(jìn)一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可區(qū)分長(zhǎng)度多態(tài)性。5、DNA擴(kuò)增指紋印跡(DNAAmplificationFingerprinting，DAF)DAF是一種改進(jìn)的RAPD分析技術(shù)，與RAPD技術(shù)不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長(zhǎng)度更短(一般為5一8bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當(dāng)使用5個(gè)核昔酸的引物時(shí)，引物和模板的組合大約可擴(kuò)增出10一100個(gè)DNA片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是在凝膠上進(jìn)行別離，通過(guò)銀染即可產(chǎn)生非常復(fù)雜帶型。6、序列標(biāo)志位點(diǎn)(SequenceTaggedSites，STS)STS是對(duì)以特定對(duì)引物序進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增的一類分子標(biāo)記的統(tǒng)稱。通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而可用來(lái)擴(kuò)增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是它產(chǎn)生信息非?？煽?，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模糊性。7、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)簡(jiǎn)單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1一6bp，其中最常見(jiàn)是雙核昔酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10一60個(gè)，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標(biāo)記的根本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反響擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)別離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。SSR具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：(l)一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)；(2)微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時(shí)必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫(kù)查尋那么首先必須對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。8、序列特異性擴(kuò)增區(qū)(Sequence—characterizedAmplifiedRegion，SCAR)SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)根底上開(kāi)展起來(lái)的。SCAR標(biāo)記是將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因DNA片段再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。SCAR標(biāo)記是共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)顯示。SCAR標(biāo)記方便、快捷、可靠，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。9、單引物擴(kuò)增反響(SinglePrimerAmplificatipnReaction，SPAR)SPAR技術(shù)是與RAPD技術(shù)相似的一種標(biāo)記技術(shù)，SPAR也只用一個(gè)引物，但所用的引物是在SSR的根底上設(shè)計(jì)的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進(jìn)行特異性結(jié)合，然后通過(guò)P(：R技術(shù)擴(kuò)增SSR之間的DNA序列，凝膠電泳別離擴(kuò)增產(chǎn)物，分析其多態(tài)性。另外，還有一種與SPAR技術(shù)非常相似的標(biāo)記技術(shù)，即ISTR(InverseSequence—taggedRepeat)技術(shù)，ISTR所用的引物是在反向重復(fù)序列根底上設(shè)計(jì)的，PCR擴(kuò)增的是反向重復(fù)序列之間的DIVA序列。10、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP)SSCP是指等長(zhǎng)的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產(chǎn)生構(gòu)象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現(xiàn)為電泳遷移率的差異。單鏈DNA構(gòu)象分析對(duì)DNA序列的改變非常敏感，常常一個(gè)堿基差異都能顯示出來(lái)。在SSCP分析中，利用PCR技術(shù)定點(diǎn)擴(kuò)增基因組DNA中某一目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，雙鏈DNA分開(kāi)成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳別離，根據(jù)條帶位置變化來(lái)判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結(jié)果判定是通過(guò)多個(gè)樣品之間比照，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個(gè)體的DNA特異性，到達(dá)指紋分析目的。為了進(jìn)一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測(cè)方法相結(jié)合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplexanalysis，Het)法結(jié)合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測(cè)的單鏈DNA或RNA進(jìn)行雜交，含有一對(duì)堿基對(duì)錯(cuò)配的雜交鏈可以和完全互補(bǔ)的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過(guò)電泳被別離開(kāi)。對(duì)同一靶序列分別進(jìn)行SSCP和Het分析可以使點(diǎn)突變的檢出率接近100%，而且實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便。11、雙脫氧化指紋法(DideoxyFingerprints，ddF)ddF是將雙脫氧末端終止測(cè)序法與SSCP結(jié)合起來(lái)的分析技術(shù)，對(duì)由雙脫氧末端終止的長(zhǎng)短不一的單鏈DNA進(jìn)行SSCP分析。如果目的片段存在一個(gè)突變，那么所有大于某一大小對(duì)應(yīng)于突主變位置的雙脫氧終止片段無(wú)野生型系統(tǒng)，對(duì)于每一個(gè)突有屢次時(shí)機(jī)檢測(cè)其遷移率改變，提高了檢測(cè)突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時(shí)因DNA長(zhǎng)度影響SSCP顯示的困難，通過(guò)一種雙脫氧核昔酸生產(chǎn)特異性的單鏈DNA，使其中長(zhǎng)度適宜的DNA片段顯示SSCP改變。12、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos開(kāi)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其根本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反響的模板DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的根底上添加1—3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板DNA基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳別離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。引物由三局部組成：與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、引物3’端的選擇堿基序列〔1—10bp〕。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列為結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)的獨(dú)特之處在于所用的專用引物可在知道DNA信息的前提下就可對(duì)酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一個(gè)酶為多切點(diǎn)，另一個(gè)酶切點(diǎn)數(shù)較少，因而AFLP分析產(chǎn)生的主要是由兩個(gè)酶共同酶切的片段。AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴，對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管AFLP技術(shù)誕生時(shí)間較短，但可稱之為分子標(biāo)記技術(shù)的又一次重大突破，被認(rèn)為是目前一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。13、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences，CAPS)CAPS技術(shù)又稱為PCR—RFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的根本原理是利用己知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特異性的PCR引物(19—27bp〕，然后用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳別離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。GAPS標(biāo)記揭示的是特異PGR片段的限制性長(zhǎng)度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是防止了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與擴(kuò)增DNA酶切，所以檢測(cè)到多態(tài)性時(shí)機(jī)較大。14、核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)SNP標(biāo)記是美國(guó)學(xué)者LanderE于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記。SNP是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異。人類基因組大約每1000bpSNP出現(xiàn)一次，已有2000多個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體，對(duì)人類基因組學(xué)研究具有重要意義。檢測(cè)SNP的最正確方法是DNA芯片技術(shù)。SNP被稱為第三代DNA分子標(biāo)記技術(shù)，隨著DNA芯片技術(shù)的開(kāi)展，其有望成為最重要最有效的分子標(biāo)記技。分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域1、基因組作圖和基因定位研究長(zhǎng)期以來(lái)，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據(jù)諸如形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標(biāo)記來(lái)構(gòu)建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數(shù)種類的生物，而且圖譜分辨率大多很低，圖距大，飽和度低，因而應(yīng)用價(jià)值有限。分子標(biāo)記用于遺傳圖譜構(gòu)建是遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一。隨著新的標(biāo)記技術(shù)的開(kāi)展，生物遺傳圖譜名單上的新成員將不斷增加，圖譜上標(biāo)記的密度也將越來(lái)越高。建立起完整的高密度的分子圖譜，就可以定位感興趣的基因。2、基于圖譜克隆基因圖位克隆(Map—bascdcloning))是近幾年隨著分子標(biāo)記遺傳圖譜的相繼建立和基因分