柴茵丹參湯對大鼠利福平肝損傷的治療作用及機制研究

柴茵丹參湯對大鼠利福平肝損傷的治療作用及機制研究

李家平（rc）是抗結(jié)核治療的首選藥物。引起的肝臟損傷是主要的副作用，這決定了抗結(jié)核治療是否順暢。筆者在臨床觀察和學(xué)習文獻資料后,認為藥毒結(jié)聚于肝,肝失疏泄,膽汁排泄不利,瘀積于內(nèi)而生濕熱;肝疏泄失常及濕熱內(nèi)蘊又導(dǎo)致血行不暢(現(xiàn)代研究認為肝組織局部存在微循環(huán)障礙),其病機應(yīng)概括為“毒擾肝郁,濕盛血瘀”,治療上采取辨證與辨病相結(jié)合的方法,在疏肝解毒利濕化瘀法則的指導(dǎo)下,組方柴茵丹參湯。筆者研究擬觀察該效方對大鼠RFP肝損傷的治療作用,并探討其機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1濃縮成生藥、制劑和護肝片的制備柴茵丹參湯(柴胡6g,制半夏9g,黃芩9g,甘草6g,茵陳蒿30g,梔子10g,制大黃6g,丹參20g)初步水煎后,在90℃恒溫水浴箱內(nèi)濃縮成生藥1.92g/ml,于4℃冰箱保存。RFP膠囊(浙江醫(yī)藥公司新昌制藥廠生產(chǎn)),以5mg/ml濃度溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中,制成混懸液。甘利欣膠囊(江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)),45mg/ml溶于蒸餾水。護肝片(黑龍江葵花藥業(yè)有限公司生產(chǎn)),0.14g/ml溶于蒸餾水。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑盒,購自寧波市慈城生化試劑廠;丙二醛(MDA)檢測試劑盒,購自南京建成生物技術(shù)研究所。1.1.2動物清潔級SD大鼠40只,雌雄各半,體重180～200g,由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。1.2方法1.2.1對rfp的生物處理40只大鼠,隨機分為正常組、模型組、中藥組、甘利欣組和護肝片組,每組8只。正常組:按5ml/kg的劑量給予去離子水灌胃。模型組:按50mg/(kg·d)的劑量給予RFP混懸液灌胃,連續(xù)21d,此后繼續(xù)喂養(yǎng)。中藥組:在RFP給藥21d后,按5ml/kg的劑量給予柴茵丹參湯濃煎劑灌胃。甘利欣組:在RFP給藥21d后,按5ml/kg的劑量給予甘利欣水溶液灌胃。護肝片組:在RFP給藥21d后,按5ml/kg的劑量給予護肝片水溶液灌胃。1.2.2肝臟mda測定各組分別治療14d后,毛細吸管眼球取血,靜置分離血清,分別按試劑盒說明書進行血清ALT活性和MDA測定;然后脫臼處死,迅速打開腹腔,取肝臟最小葉修剪成0.1cm×0.1cm×0.2cm大小,迅速投入提前4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定,進行超微結(jié)構(gòu)觀察;取肝臟中葉,盡快儲存于冰箱-20℃,進行組織MDA測定;最后取肝臟最大葉投入10%中性甲醛中固定,進行組織病理觀察。1.3統(tǒng)計處理方法采用四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院黃志勇等研制的PEMS3.1(2003年版)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件,進行計量資料的正態(tài)性檢驗和計量資料的t檢驗。2結(jié)果2.1各組血清活性、mda和肝組織mra的程度結(jié)果見表1。2.2各組kupffer細胞凋亡程度的比較造模后大鼠光鏡下肝細胞水腫、胞質(zhì)疏松,甚至呈現(xiàn)氣球樣變性,肝小葉中央靜脈附近肝細胞脂肪變性、肝血竇擴張充血,可見散在的點狀壞死、片狀壞死及壞死局部炎細胞浸潤,門管區(qū)kupffer細胞增生,中央靜脈附近可見凋亡小體。中藥組、甘利欣組、護肝片組與模型組比較,肝細胞水腫、脂肪變性、壞死等病變均較輕微,門管區(qū)亦可見少量kupffer細胞增生。3組之間比較,實驗組凋亡小體數(shù)量相對較少,甘利欣組壞死灶稍多,護肝片組肝血竇擴張充血明顯。各組之間病理組織學(xué)有一定差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義。2.3中藥中凋亡的細胞的形態(tài)變化正常肝細胞核大而圓,胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達的粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體,常染色質(zhì)豐富而著色淺,可見較多糖原顆粒。模型組肝細胞可見明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,呈小囊泡狀,部分出現(xiàn)脫顆粒改變;線粒體腫脹、肥大和退行性變,線粒體嵴斷裂或結(jié)構(gòu)模糊不清(圖1);胞質(zhì)內(nèi)小脂滴較多;可見多個凋亡早期的細胞核,染色質(zhì)濃縮、邊集,呈現(xiàn)花瓣狀或環(huán)狀(圖2),核周細胞器退變;部分Disse腔和膽小管內(nèi)微絨毛增多(圖3)。中藥組肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張、線粒體病變輕微,可見較多形狀不規(guī)則細胞核(圖4),凋亡的肝細胞數(shù)量相對較少。甘利欣組和護肝片組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體病變較模型組也稍輕,凋亡細胞也較少,但肝細胞內(nèi)小脂滴仍較多。3治療以養(yǎng)肝作用為主,局部治療作用發(fā)揮不顯著抗結(jié)核藥肝損傷乃中醫(yī)“藥毒”致病,與“黃疸”“脅痛”“積聚”等類似,其病在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之肝而實屬中醫(yī)脾胃范疇。早在《素問·五常政大論》就有“病有久新,方有大小,有毒無毒,固宜常制?！瓱o使過之,傷其正也”的論述;《諸病源候論·蠱毒病諸候下·服藥失度候》亦云:“凡合和湯藥,自有限劑,至于圭、銖、分、兩,不可乖違。若增加失宜,便生他疾”,強調(diào)藥物劑量不隨意增大,否則可招致其他病變。柴茵丹參湯由《金匱要略》小柴胡湯去人參、生姜、大棗合茵陳蒿湯、一味丹參飲組成。方中柴胡功擅疏肝解郁,《滇南本草》謂之“除肝家邪熱、癆熱”;黃芩苦寒,能“主諸熱黃疸”;半夏辛溫,可降逆止嘔,燥濕和胃;甘草性甘平,生用具“解百藥毒”之功。該病邪毒屬實,故去原方扶正之參、姜、棗;合《金匱要略》治療濕熱黃疸的主方茵陳蒿湯,使?jié)駸釓男”愠?加“善治血分,去淤生新”的丹參,可使肝氣疏,藥毒解,濕邪祛,瘀血化。實驗中模型組大鼠在停止RFP給藥14d后ALT活性仍明顯高于正常(P<0.01),提示RFP可在體內(nèi)蓄積,其肝毒性存在延遲效應(yīng),而不會在停藥后自行恢復(fù)。中藥組、甘利欣組、護肝片組治療后ALT雖低于模型組(P<0.01,<0.05,<0.01),但仍高于正常(均P<0.01),提示3種治療方法只能在一定程度上降低RFP引起的ALT升高,臨床有必要在抗結(jié)核治療的同時及早用藥以減輕RFP肝損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一,其水平不僅能反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,而且可間接反映細胞受自由基攻擊后損傷的程度,是肝損傷研究中的常用指標。實驗中模型組大鼠在停止給藥14d后血清和肝組織MDA水平仍明顯高于正常組(均P<0.01),說明蓄積的RFP可繼續(xù)增強大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化作用,加重肝細胞的損傷。經(jīng)治療后,中藥組和護肝片組血清及肝組織MDA水平均顯著下降(P<0.01,<0.01,<0.05,<0.05),提示柴茵丹參湯和護肝片可通過對肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化過程的抑制,起到減輕肝細胞損傷的作用。甘利欣組血清MDA水平雖明顯低于模型組(P<0.01),但與正常組比較仍略高(P<0.05),而其肝組織MDA與模型組之間無差異,說明甘利欣雖然對脂質(zhì)過氧化也有一定的抑制作用,但療效稍差。模型組繼續(xù)喂養(yǎng)14d后,肝細胞水腫、脂肪變性和壞死仍較嚴重,這與血清ALT、血清和肝組織MDA檢測結(jié)果是一致的,提示了RFP的蓄積作用。從實驗病理組織變化結(jié)果來看,各組之間雖有一定差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義,似與組織病理表現(xiàn)改善緩慢有關(guān),也說明有必要在今后的工作中繼續(xù)完善治療方法。模型組肝細胞超微結(jié)構(gòu)明顯異常也支持RFP肝毒性的蓄積效應(yīng);實驗組觀察到的較多形狀不規(guī)則的肝細胞核,在不同程度上增加了細胞核與細胞質(zhì)的接觸面積,為核/質(zhì)之間物質(zhì)交換提供了更多的機會