高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中黃體酮的濃度

高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中黃體酮的濃度

黃體酮是臨床上常用的酪氨酸酶之一。主要用于月經(jīng)疾病、功能性子宮出血、黃土機(jī)制不全引起的早發(fā)性生殖器和正常流產(chǎn)。天然的黃體酮口服給藥由于肝臟的首過(guò)效應(yīng)生物利用度很低。為了維持血漿中有效的血藥濃度,口服需要多次給藥。近年來(lái),脂質(zhì)納米粒由于具有很好的生物相容性和較高的生物利用度受到關(guān)注。黃體酮為脂溶性藥物,能有效包裹于脂質(zhì)納米粒中,因此可以將其制備成脂質(zhì)納米粒,以提高其生物利用度。為探索黃體酮脂質(zhì)納米粒的藥動(dòng)學(xué)特征,本試驗(yàn)建立了黃體酮的血藥濃度HPLC測(cè)定法,并對(duì)黃體酮脂質(zhì)納米粒經(jīng)大鼠口服給藥后的生物利用度進(jìn)行了研究。1黃體酮和達(dá)那唑Agilent1100高效液相色譜儀(安捷倫公司);3K30高速離心機(jī)(Sigma公司);FA1104電子天平(上海天平儀器廠)。黃體酮脂質(zhì)納米粒(由浙江大學(xué)藥學(xué)院自制);黃體酮對(duì)照品(浙江仙居制藥股份有限公司);達(dá)那唑(浙江仙居制藥股份有限公司);甲醇和其他試劑均為色譜純。SD大鼠雄性,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SYXK(浙2004-0052)。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:HypersilC18柱(150mm×3.9mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇∶水(60∶40);流速0.6μg/ml;檢測(cè)波長(zhǎng):240nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:50μl。2.2成工作液5.精密稱(chēng)取黃體酮對(duì)照品10.00mg,加甲醇溶解,使成1mg/ml的儲(chǔ)備液。精密吸取該貯備液1ml,加甲醇稀釋,使成工作液(100μg/ml),置4℃冷藏備用。稱(chēng)取達(dá)那唑10.00mg,加甲醇溶解,使成1mg/ml的儲(chǔ)備液,作為內(nèi)標(biāo),4℃冰箱內(nèi)保存。2.3酶處理法精密移取血漿樣品200μl,加入內(nèi)標(biāo)溶液20μl,用乙酸乙酯1.00ml提取,渦旋3min,離心(4000r/min,10min),精密吸取上清液0.7ml,在45℃水浴下高純度氮?dú)獯蹈?殘余物用100μl流動(dòng)相溶解,漩渦混合2min,4000r/min離心10min,取上清液進(jìn)樣測(cè)定。2.4所得譜圖的分析取空白血漿和供試血漿,按“2.3”項(xiàng)下處理,進(jìn)樣,所得譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)在上述色譜條件下,黃體酮和內(nèi)標(biāo)有較好的分離度,空白血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)黃體酮和內(nèi)標(biāo)的分析無(wú)干擾,因此本法具有較好的專(zhuān)屬性。2.5黃體酮濃度線(xiàn)性回歸用空白血漿將黃體酮標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成相當(dāng)于血藥濃度為0.02、0.5、0.1、0.2、1、2μg/ml的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿,按“2.3”項(xiàng)下操作,以(A/A內(nèi))-(A空/A內(nèi))(其中A空為空白血漿中的黃體酮)對(duì)黃體酮濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果黃體酮在0.02~2μg/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,回歸方程為:Y=1.993X-0.0456(r=0.9999,n=3),定量限為(0.02±0.004)μg/ml(n=3),最低檢測(cè)限為0.005μg/ml(S/N≥3)。2.6黃體酮回收率測(cè)定結(jié)果用空白血漿將黃體酮稀釋成相當(dāng)于血藥濃度為0.02、0.2、2μg/ml的3種質(zhì)控血漿,按“2.3”項(xiàng)處理后測(cè)定,以相同濃度純?nèi)軇┡渲频膶?duì)照品的色譜峰面積為參比,計(jì)算絕對(duì)回收率;以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算方法回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。按照同樣的方法測(cè)定內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)回收率為88.3%,與黃體酮的絕對(duì)回收率相近,符合要求。再按此方法考察黃體酮的日內(nèi)(每日測(cè)定6次)、日間精密度(測(cè)定6d,每天1次),結(jié)果均小于10%,符合生物樣品測(cè)定的要求。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)2.7.1黃體酮含量測(cè)定血藥濃度為0.02、0.2、2μg/ml的3種質(zhì)控血漿,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,分別于0、4、8、l2和24h測(cè)定黃體酮含量,結(jié)果各濃度的回收率在98.3%~105.4%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7.2凍融穩(wěn)定性測(cè)定:樣品在冷凍保存后反復(fù)導(dǎo)致的穩(wěn)定性測(cè)定,樣品在冷凍融后穩(wěn)定性良好。經(jīng)過(guò)凍融后人0.02、0.2、2μg/ml3種質(zhì)控血漿即時(shí)測(cè)定,再冷凍保存24h后,在室溫條件下解凍后測(cè)定,連續(xù)測(cè)定3次,結(jié)果各濃度的回收率為95.76%~103.5%,表明樣品經(jīng)過(guò)凍融后的穩(wěn)定性良好。2.7.3黃體酮冷凍保存穩(wěn)定性試驗(yàn)0.02、0.2、2μg/ml3種質(zhì)控血漿即時(shí)測(cè)定,于-20℃冷凍保存15d后再次測(cè)定,各濃度的回收率為94.55%~106.3%,表明黃體酮冷凍保存15d內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2.8.1大鼠sd大鼠卵巢內(nèi)固定術(shù)為消除動(dòng)物本身激素水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,實(shí)驗(yàn)以去勢(shì)大鼠作為模型動(dòng)物。取體重約200g的雌性SD大鼠,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,固定,于下肢腹股溝位腹中線(xiàn)縱向切開(kāi)約1cm的切口,以手術(shù)線(xiàn)靠近卵巢處結(jié)扎所連接的輸卵管,取出卵巢,將輸卵管放回到原來(lái)的方位,縫合切口,繼續(xù)飼養(yǎng)三周后使用。2.8.2生物利用度檢測(cè)取去勢(shì)大鼠18只,隨機(jī)分為3組,實(shí)驗(yàn)前禁食12h。以2mg/100g的劑量分別灌胃給予黃體酮脂質(zhì)納米粒和黃體酮油溶液(劑量為3mg/100g,作為對(duì)照),于給藥前及給藥后0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36h從尾靜脈取血0.5ml,肝素抗凝,4000r/min離心后取血漿。精密吸取血漿樣品200μl,按“2.3”項(xiàng)下方法處理,測(cè)定藥物含量。依據(jù)(1)式計(jì)算脂質(zhì)納米粒相對(duì)于油溶液的生物利用度。相對(duì)生物利用度Frel=(AUCT×DR)/(ATUR×DT)×100%(1)其中T與R分別為受試制劑與參比制劑,D為給藥劑量。黃體酮油溶液和黃體酮脂質(zhì)納米?？诜o藥后,血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)血藥濃度有兩個(gè)峰值,前一個(gè)峰納米制劑和對(duì)照溶液都出現(xiàn)在1~3h內(nèi);而后一個(gè)峰納米制劑給藥出現(xiàn)的相對(duì)較晚,在6~12h內(nèi),而對(duì)照溶液的峰值在4~8h內(nèi)。根據(jù)梯形法計(jì)算得到黃體酮脂質(zhì)納米粒和對(duì)照油溶液的AUC0~36h分別為7.2656和5.6387μg/h/L,黃體酮脂質(zhì)納米粒的生物利用度為對(duì)照油溶液的1.93倍。3黃體酮含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果在黃體酮的提取溶劑的選擇中,我們比較了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚,發(fā)現(xiàn)三氯甲烷和二氯甲烷對(duì)黃體酮提取率非常低,乙醚對(duì)黃體酮的提取率比較低,而乙酸乙酯具有理想的提取率,干擾少,峰形尖銳、對(duì)稱(chēng),兩峰分離度良好,故選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。在尋找內(nèi)標(biāo)的過(guò)程中,我們?cè)囼?yàn)了多種化合物,發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下,達(dá)那唑除了保留時(shí)間合適,與黃體酮的分離度較好外,其穩(wěn)定性也非常好,故選用達(dá)那唑做內(nèi)標(biāo)。為消除大量存在的內(nèi)源性黃體酮對(duì)測(cè)定的干擾,本研究選用去勢(shì)大鼠為模型動(dòng)物,測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白血漿中還有少量的內(nèi)源性黃體酮存在,但含量相對(duì)恒定,6份空白血漿中的黃體酮含量的RSD為3.23%,可以認(rèn)為生理性的黃體酮不影響外源性黃體酮的測(cè)定。有報(bào)道使用放射免疫法測(cè)定血漿中黃體酮的含量,但是因?yàn)閮r(jià)格昂貴,不適合大部分實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用研究。而本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法,測(cè)定大鼠血漿中黃體酮的含量的方法成本低,具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等特點(diǎn),適用于黃體酮納米制劑口服給藥后的血漿中藥物含量的測(cè)定。通過(guò)測(cè)定大鼠血漿藥物濃度發(fā)現(xiàn),黃體酮脂質(zhì)納米粒和對(duì)照溶液都可以在胃腸道內(nèi)較快被吸收進(jìn)入體循環(huán)?？赡苡捎诟文c循環(huán)的作用,兩種制劑給藥后均出現(xiàn)了第二個(gè)峰。但脂質(zhì)納米粒給藥的第二個(gè)峰濃度較油溶液更高,且延續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),這個(gè)現(xiàn)象與我們以往的研究結(jié)果類(lèi)似,即脂質(zhì)