荔枝核提取物對(duì)hmg模型大鼠乳腺er和pr表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

荔枝核提取物對(duì)hmg模型大鼠乳腺er和pr表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

乳房增生是一種常見的女性疾病。發(fā)病年齡在20至50歲之間。50歲后，發(fā)病率急劇下降。發(fā)病率約占所生育期婦女的40%，占所有乳房疾病的75%，是最常見的乳房疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,乳腺增生病與內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)。荔枝核含有氨基酸、多糖、總皂苷和黃酮類化合物等活性成分。大量的藥理實(shí)驗(yàn)和醫(yī)學(xué)臨床證實(shí),荔枝核具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化作用。近年研究表明,荔枝核能抑制雌激素性乳腺增生病(HMG)大鼠乳腺組織增生,并調(diào)節(jié)病鼠性激素水平。本研究擬進(jìn)一步探討荔枝核對(duì)HMG大鼠乳腺組織雌二醇受體(ER)和孕酮受體(PR)表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用。1材料表面1.1xsz-d型生物顯微鏡CX41-32RFL型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);-80℃冰箱(美國(guó)Thermofora公司);XSZ-D型倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);低溫高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);RM2135型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);FACS440型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bectondickinson公司)。1.2試劑與試劑盒荔枝核提取物顆粒(廣東一方制藥有限公司,批號(hào):0604229);苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號(hào)分別為H20020529、H200205534);乳結(jié)平(廣東彼迪藥業(yè)有限公司,批號(hào):H44025162);SABC免疫組化染色試劑盒(批號(hào):SA1026)、DAB顯色試劑盒(批號(hào):AR1022)、ER試劑盒(批號(hào):BA0345)、PR試劑盒(批號(hào):BA0107)均購于武漢博士德生物工程有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3動(dòng)物SPF級(jí)SD未孕大鼠60只,♀,150~180g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):SCXX(粵)2003-0002)。2方法和結(jié)果2.1模型復(fù)制參考文獻(xiàn)復(fù)制模型,im苯甲酸雌二醇(0.5mg·kg-1)25d后,改im黃體酮(4mg·kg-1)5d,即得。2.2連續(xù)給藥對(duì)刺槐枝核的影響實(shí)驗(yàn)分為6組,即正常(蒸餾水)、模型(蒸餾水)、乳結(jié)平(3.3g·kg-1)及荔枝核高、中、低劑量(44、22、11g·kg-1)組,于復(fù)制模型第31天開始ig給藥,連續(xù)給藥30d。2.3大鼠前推乳后會(huì)對(duì)大鼠血清中第3對(duì)小鼠血清紅外圓的影響表3實(shí)驗(yàn)開始后,連續(xù)觀察各組大鼠的一般狀況,未見大鼠進(jìn)食、飲水和體質(zhì)量改變。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左側(cè)腋窩下第3對(duì)乳頭的直徑和高度1次。結(jié)果表明,復(fù)制模型后大鼠乳頭出現(xiàn)紅腫或增大,經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核處理30d后,病鼠乳頭紅腫或增生顯著減輕(P<0.01)。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳頭形態(tài)的影響見表1、表2。2.4免疫組化檢測(cè)er和pr表達(dá)末次給藥24h后,按隨機(jī)數(shù)字表法從每組中隨機(jī)抽取6只大鼠,脫頸處死動(dòng)物,經(jīng)乳頭基底部最大切面取下大鼠右側(cè)第2對(duì)完整乳腺組織,用10%甲醛溶液固定,常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋,石蠟切片脫蠟脫水;參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行免疫組化染色并觀察結(jié)果。ER和PR陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞核著色。陽性細(xì)胞率<20%者為(-);陽性細(xì)胞率不足20%,但局部區(qū)域有少量較強(qiáng)著色的陽性細(xì)胞者為(±);陽性細(xì)胞率>20%者,按陽性細(xì)胞數(shù)由少至多、著色由淺至深為+、++、+++、++++,并分別計(jì)1、2、3、4、5、6分,積分愈高表明ER和PR含量愈高。結(jié)果表明,模型組大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著增強(qiáng),與正常組大鼠比較有顯著差異(P<0.01);經(jīng)乳結(jié)平和荔枝核給藥各組處理后,乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)的影響見表3。2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取大鼠乳腺組織,于0.5mLPBS液中剪碎,加入0.125%的胰酶消化液200μL,冰浴中消化5min,加入含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基200μL停止消化。溶液過200目篩后4℃冷凍,1300r·min-1離心5min,棄上清,細(xì)胞沉淀用PBS液800~1000r·min-1離心洗滌3次。收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為約每1mL含1×106個(gè),于預(yù)冷的70%乙醇中固定,4℃下貯藏;檢測(cè)前以1000r·min-1離心5min,棄上清后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至每1mL含1×106個(gè),10mg·L-1碘化丙啶室溫下染色30min;尼龍網(wǎng)過濾,流式細(xì)胞儀檢測(cè),經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)Cellquest軟件分析,繪制細(xì)胞數(shù)-DNA分布圖,計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例,用百分比表示。結(jié)果表明,正常、模型組大鼠乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞較少,無顯著性差異(P>0.05);荔枝核提取物高、中劑量組大鼠乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細(xì)胞(P<0.01或P<0.05);荔枝核提取物低劑量、乳結(jié)平組的凋亡細(xì)胞變化較小,無顯著差異(P>0.05)。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠乳腺組織細(xì)胞凋亡的影響見表4。2.6各組大鼠精子指數(shù)的比較分別剖取大鼠的子宮稱重,與相應(yīng)大鼠的體質(zhì)量進(jìn)行換算,得出子宮指數(shù)。結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠子宮指數(shù)顯著升高(P<0.01);與模型組比較,荔枝核高、中劑量組大鼠子宮指數(shù)顯著降低(P<0.05),而荔枝核低劑量組大鼠子宮指數(shù)也呈減小趨勢(shì),但無顯著性差異(P>0.05)。荔枝核提取物對(duì)模型大鼠子宮指數(shù)的影響見表5。3hgm大鼠乳腺癌er和pr檢測(cè)及病理改變隨著社會(huì)發(fā)展,社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)加大、心理壓力增加、膳食結(jié)構(gòu)不合理等因素使乳腺疾病發(fā)病率急劇增加。一直以來,HMG被認(rèn)為與患者內(nèi)分泌紊亂、雌激素水平過高及乳腺局部組織對(duì)雌激素過于敏感有關(guān)。Strange等證明,雌二醇(E2)和孕酮(P)水平在大鼠的性周期產(chǎn)生變化,并調(diào)節(jié)乳腺上皮的增殖與凋亡。研究表明,胰島素生長(zhǎng)因子-1、表皮生長(zhǎng)因子和性激素通過mTOR通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的自噬作用,使乳腺上皮細(xì)胞的增殖與凋亡達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。ER和PR是一種蛋白質(zhì),對(duì)E2和P具有高選擇性、高親和力并與其結(jié)合的生理功能特點(diǎn)。當(dāng)E2升高時(shí),促使正常上皮細(xì)胞增殖,致使乳腺增生的發(fā)生;另一方面,抑制細(xì)胞免疫,使乳腺組織自身修復(fù)能力降低,增生的上皮細(xì)胞通過激素受體系統(tǒng)使ER合成增加,隨之代表ER活性的PR亦增多,隨著ER和PR合成的增多,E2進(jìn)一步刺激引起乳腺上皮細(xì)胞的增生和細(xì)胞功能活躍。性激素受體ER和PR的檢測(cè)結(jié)果說明了HMG與ER和PR的相關(guān)性,顯示乳腺良性病變中存在ER和PR,且表達(dá)較高。HMG隨著增生程度的加重,其ER和PR有顯著增加的趨勢(shì)。當(dāng)大鼠乳腺組織形態(tài)表現(xiàn)為顯著增生時(shí),乳腺ER和PR病理積分也顯著升高。黃勤等研究表明,雌激素受體顯著增多,對(duì)雌激素感受性增加,可導(dǎo)致HMG甚至癌變。本研究結(jié)果表明,大鼠經(jīng)im苯甲酸雌二醇出現(xiàn)乳腺小葉、腺泡上皮增生、導(dǎo)管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫等病理性改變;后期施用孕酮,進(jìn)一步促進(jìn)腺泡發(fā)育。說明外源性性激素的異常刺激可造成大鼠乳腺組織的病理性增生,其改變與人體HMG病理類似,成功模擬HMG病理模型。對(duì)HMG大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)及細(xì)胞凋亡、子宮指數(shù)的觀察,與正常組比較,模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著增強(qiáng),乳腺組織出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞較少,子宮指數(shù)顯著增高;荔枝核3個(gè)劑量組均可使模型大鼠乳腺組織ER和PR表達(dá)顯著降低,乳腺組織出現(xiàn)較高的凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞,子宮指數(shù)顯著減少。由此推測(cè),HMG的發(fā)病除了過高的E2直接刺激或P值降低不能保護(hù)乳腺組織的作用外,乳腺組織中ER和PR含量增加使組織對(duì)性激素的敏感性增強(qiáng)也是此病發(fā)生的另一重要因素。HMG屬中醫(yī)“乳癖”、“乳痞”、“乳中結(jié)核”等范疇,臨床以乳房疼痛、腫塊