免疫組化染色的常見問題及定量分析

免疫組化染色的常見問題、

激光顯微切割及冰凍切片1整理課件免疫組化原理和方法

定義：組織化學(xué)HistochemistryDealingwithidentificationofchemicalcomponentsincellsandtissues.2整理課件概念：利用的特異性抗體與抗原能特異性結(jié)合這一特點(diǎn)，通過化學(xué)反響，使標(biāo)記于特異性抗體上的顯示劑顯色，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，了解抗原表達(dá)情況的一門組化技術(shù)。3整理課件原理：利用抗原抗體能夠特異性結(jié)合這一原理，從而在組織細(xì)胞水平進(jìn)行抗原抗體反響。4整理課件一抗的類別蛋白質(zhì)肽類酶類激素類糖類脂質(zhì)類抗原5整理課件顯示劑酶金屬離子同位素?zé)晒夥肿?整理課件底物DAB(3,3-二胺基聯(lián)苯胺)AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)

堅牢藍(lán)核固紅7整理課件免疫組化的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)：抗原與抗體的“一對一〞的特異結(jié)合，僅當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時會出現(xiàn)交叉反響。敏感性高定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合8整理課件免疫組化技術(shù)操作上的優(yōu)點(diǎn)方法簡單，易掌握在組織切片原位顯示抗原的表達(dá)情況試驗條件要求不高，絕大多數(shù)實(shí)驗室都可滿足其需要。不需要特殊、貴重的儀器。9整理課件免疫組化染色的缺點(diǎn)為半定量分析，不能進(jìn)行定量分析。受實(shí)驗者技術(shù)水平影響較大。結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)。10整理課件步驟二甲苯脫蠟30'×2梯度酒精復(fù)水〔100%×2，95%，90%，85%，每次5'，蒸餾水〕雙氧水阻斷非特異性過氧化物酶〔0.3%-3%〕抗原修復(fù)〔酶，微波，高壓鍋〕二抗同種屬血清封閉抗原非特異性表達(dá)〔BSA，山羊血清〕一抗4℃過夜復(fù)溫二抗DAB顯色蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，流水返藍(lán)脫水、透明，中性樹膠封片11整理課件染色中各步驟本卷須知及原理前期處理染色后期處理12整理課件

前期不可控制因素：取材、固定、脫水、透明、浸蠟，包埋可控制因素：撈片：注意不要太靠近一側(cè)，必要時用鑷子壓住組織片控水13整理課件染色過程中的影響因素阻斷非特異性過氧化物酶抗原修復(fù)封閉抗原非特異性表達(dá)一抗二抗DAB顯色14整理課件

內(nèi)源性HRP的消除

分布:

腦，脾，中性WBC，巨噬細(xì)胞。血紅蛋白和肌紅蛋白含有鐵卟啉具有內(nèi)源性HRP活性

15整理課件內(nèi)源性HRP的消除:

3%H2O2,5-10’0.3%H2O2甲醇溶液,15-60’0.1%HCl酒精溶液,30’0.2%醋酸甲醇溶液,30’0.01%過碘酸5-10’,0.1%硼酸鈉10’

16整理課件抗原修復(fù)甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉了局部抗原決定簇甲醛在保存進(jìn)程中會形成羧甲基，而封閉抗原決定簇在用固定劑固定時，會使蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，也可能會封閉抗原決定簇17整理課件抗原修復(fù)方法化學(xué)方法物理／化學(xué)方法18整理課件化學(xué)方法一.胰蛋白酶(tyrpsin)消化方法：1.配制：取0.05g或0.1g胰蛋白酶參加到100ml0.05%或0.1％,PH7．8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可用。2.消化條件和時間：將切片放置在濕盒內(nèi)，37℃10一40min，一般為20min即可。19整理課件二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法1.配制：0.4％胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。2.消化時間：37℃20min。3.用途：主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如纖粘素、膠原酶等20整理課件三．鏈霉蛋白酶消化方法四．無花果蛋白酶消化方法五.菠蘿蛋白酶消化方法六．尿素消化方法21整理課件物理／化學(xué)方法單純加熱方法：將片子放入盛有抗原修復(fù)液的容器中，置電護(hù)上加熱至沸騰，并持續(xù)10min。微波方法：將片子放入盛有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱使溫度保持在92—100℃?？倳r間10min，但必須有間隔。22整理課件

高壓鍋免疫組化抗原修復(fù)程序切片放在染色架上(不宜太密)高壓鍋參加0.01M枸櫞酸鈉緩沖液3L，染色放在枸櫞酸鈉緩沖液內(nèi)，加蓋，煮沸，冒氣后，加上限壓閥加壓1-5’〔通常選擇2分鐘〕晾涼取出23整理課件檸核酸鹽緩沖液的配制A液：稱取21．01g檸檬酸溶于1000ml蒸餾水中。B液：稱取29．41g檸檬酸鈉溶于1000ml蒸餾水中。工作液：取9mlA液和41mlB液，參加450ml蒸餾水，調(diào)PH＝6.0士0.1。24整理課件抗體的保存和配制25整理課件抗體的保存

*分裝,低溫,防止反復(fù)凍融*硅化,防止蛋白吸附*防止交叉污染和細(xì)菌污染26整理課件分裝按5μl或10μl分裝，并注明標(biāo)記(批號、名稱、效價、量)，密封。故入-20℃一-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?，一般可保?—2年。PBS稀釋的抗體不能長時間保存，在4℃可放1—3天，超過7天效價顯著降低。防止反復(fù)凍融而使抗體效價降低27整理課件即用型抗體

一般4℃保存效價穩(wěn)定在一年以上．28整理課件抗體的配制根據(jù)說明書推薦濃度，進(jìn)行倍比稀釋自制抗體根據(jù)酶標(biāo)結(jié)果，進(jìn)行倍比稀釋。最好采用抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，如無抗體稀釋液，可采用PBS進(jìn)行稀釋。29整理課件其他準(zhǔn)備工作中的本卷須知蓋玻片需過酸3-5分鐘，流水沖洗1小時以上蓋玻片的儲存：浸泡于95-100%的Alc中，隨用隨擦，注意沖洗好的蓋玻片呈無色或淡藍(lán)色，如發(fā)黃請重新沖洗干凈。用廢白衣擦蓋玻片效果較好配制緩沖液注意桌面和濕盒的情況，如不平可用紙墊平30整理課件

免疫組化染色不理想的處理31整理課件32整理課件33整理課件34整理課件

非特異性染色的消除最大限度稀釋抗體

35整理課件修改封閉方法*二抗同種屬正常血清阻斷，很多背景染色深的原因是正常動物血清使用不合理，如第二抗體為羊抗鼠IgG，應(yīng)該用羊的正常血清。*羊血清*BSA阻斷*羊血清+BSA*5%脫脂奶36整理課件DAB顯色過程中的問題DAB顯色：一般2-5分鐘，最多不要超過10分鐘DAB顯色過快，少于一分鐘時，注意一次顯色的片子不要超過5張。注意DAB渣子的問題，配好的DAB顯色液應(yīng)為清亮，微帶煙色，如看到顆粒樣物或呈棕色，應(yīng)予以過濾37整理課件抗原的“例外〞表達(dá)細(xì)胞的分化不同階段其抗原性有相應(yīng)變更，可解釋這些抗原的“例外〞表達(dá)。38整理課件出現(xiàn)背景著色的其他幾種原因內(nèi)源性過氧化物酶沒有完全阻斷。脫蠟不夠徹底。組織粘貼劑使用不當(dāng)或太濃。PBS沖洗不夠?？贵w稀釋不合理，濃度太高底物顯色時間太長。39整理課件染色背景過深的處理采用不同的封閉方法，直至5%的脫脂奶。梯度稀釋一抗，降低一抗?jié)舛?，選擇最適的抗體稀釋度。40整理課件特異性差的處理選擇相應(yīng)比較適宜的抗體稀釋度，延長一抗4℃孵育時間，必要時可以采用4℃2-3天。41整理課件假陽性的原因抗體與多種抗原有交叉反響抗體與組織中某些成分的非特異性結(jié)合內(nèi)源性酶的顯色腫瘤或病變中有其他組織殘留，尤其是腫瘤中剩余極少的正常組織，而正常組織此時又有一定程度的增生或萎縮時，易將其誤認(rèn)為腫瘤成分抗原的彌散或被瘤細(xì)胞吞噬而使抗原在不該出現(xiàn)的部位出現(xiàn)，如何杰金病Rs細(xì)胞中的免疫球蛋白異位抗原的表達(dá)，42整理課件假陰性的原因(1)抗體己失活、濃度不當(dāng)或抗體本身達(dá)不到應(yīng)有的敏感度，不管是自產(chǎn)抗體、國外贈送的抗體還是商品化的抗體，都會有抗體不能顯示相應(yīng)抗原的現(xiàn)象(2)抗原喪失或減弱，當(dāng)標(biāo)本處理不當(dāng)時更容易出現(xiàn)，如固定不良、溫度過高(3)操作步驟不當(dāng)，即純技術(shù)上的失誤，如反響時間不夠或過久、洗脫不夠等。43整理課件陰性染色的處理抗原修復(fù)方法是否正確一抗?jié)舛仁欠襁^低，適當(dāng)提高一抗?jié)舛纫豢故欠窨煽抗潭ê蜏囟?。許多抗體不適合用于福馬林固定的組織，僅適合于冰凍切片44整理課件注意：整個操作過程中注意一定要防止干片?。?！免疫組化的精髓是低濃度，長時間！??！45整理課件復(fù)染每次復(fù)染前需用報紙清潔蘇木素染液外表的浮渣，如蘇木素已使用時間較長可用濾紙過濾。復(fù)染時間一般1-2分鐘即可。必須進(jìn)行復(fù)染，否那么會影響結(jié)果的觀察。46整理課件47整理課件分色的問題分色液通常采用0.5-2%的鹽酸酒精，分色時間應(yīng)根據(jù)切片脫色程度而定，但最長不超過1分鐘，如果一分鐘分色仍無效果，建議更換分色液。復(fù)染后的免疫組化切片必須經(jīng)過分色，否那么會影響陽性結(jié)果的判斷。48整理課件封片的問題手工封片一定要注意封片膠的用量，切勿使用太多。49整理課件50整理課件

對照

陽性對照，陰性對照空白對照，替代對照自身對照，平行對照

51整理課件

結(jié)果判斷背景干凈,定位準(zhǔn)確

52整理課件53整理課件54整理課件55整理課件判定標(biāo)準(zhǔn)紀(jì)小龍在1996年版的?診斷免疫組織化學(xué)?P25提出：間質(zhì)清晰，無背景著色，同時陽性細(xì)胞要在5%以上，才能定為陽性。目前通常以陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的10%以上定為陽性，僅散在表達(dá)或表達(dá)量低時，才選擇5%陽性為陽性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)染色的強(qiáng)度，分為+，++，+++。56整理課件乳腺癌Her2染色結(jié)果判讀乳腺癌必須滿足細(xì)胞膜染色形態(tài)、強(qiáng)度及百分比陽性腫瘤細(xì)胞〔超出10%〕閾值標(biāo)準(zhǔn)，才被視為Her2蛋白過表達(dá)陽性。染色必須定位于細(xì)胞膜與圓周〔完整染色〕。57整理課件羅氏公司VENTANAHER2判讀指南染色情況評分（報告至臨床醫(yī)生）Her2染色評估未見膜染色0陰性腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中度完整的細(xì)胞膜染色1+陰性大于10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中度的完整的細(xì)胞膜染色2+可疑大于10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜染色3+陽性58整理課件切片的觀察閱片忌先用高倍鏡。一定要遵循先低倍后高倍的原那么59整理課件貼簽注明病理號，所用一抗名稱，抗體稀釋度，染色日期60整理課件

PALM激光顯微切割系統(tǒng)是由德國PALM公司研發(fā)的一套高級精確的實(shí)驗室設(shè)備。利用337納米的紫外激光對顯微鏡下的生物樣本(組織、細(xì)胞簇、單細(xì)胞、染色體及染色體片斷等〕進(jìn)行切割和別離。在病理學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等多個科研領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用。PALM激光顯微切割系統(tǒng)簡介

61整理課件62整理課件63整理課件64整理課件65整理課件

1、精確其切割精度可達(dá)1個微米,完全可以勝任染色體級別的切割操作,是同類產(chǎn)品中唯一可以切割染色體的系統(tǒng)。2、平安由于采用了337納米的平安紫外激光,不會對生物樣本造成損害和變異,同時防止了紅外光的熱效應(yīng)。

PALM激光顯微切割系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn):

66整理課件3、高純度采用了PALM公司的LPC(激光彈射收集〕技術(shù),對目標(biāo)先進(jìn)行切割,然后發(fā)射一個激光脈沖,把目標(biāo)向上彈射,進(jìn)入收集裝置。整個過程簡單,沒有任何機(jī)械接觸,無污染,不需要特殊耗材。4、人性化操作一個好的工具在操作上應(yīng)該是簡單合理的。PALM通過一個智能化軟件PALMRobot可以完成所有的切割工作,也就是說所有的工作都用鼠標(biāo)完成。一個熟練的操作者完成一個操作只需要幾十秒的時間。67整理課件

5、靈活

PALM的操作可以將整個片子上所有感興趣的區(qū)域標(biāo)記出來,然后點(diǎn)擊切割按鈕,從切割到收集一切工作可以自動完成。此外還可以用不同顏色標(biāo)記出不同種類的細(xì)胞,軟件會自動分次收集同類細(xì)胞?？梢宰詣佑嬎愠雒總€區(qū)域的面積。所有的區(qū)域都可以以文件的形式儲存在電腦中,配合上位置記憶功能,這樣同一張片子在任何時候都可以拿出來進(jìn)行分析,而無需進(jìn)行繁瑣的重復(fù)性勞動。可以隨時將屏幕上的畫面存檔?？梢杂每旖萱I或鼠標(biāo)隨時調(diào)節(jié)激光的能量和聚焦位置。

68整理課件激光顯微切割的缺點(diǎn)未封片的組織切片組織結(jié)構(gòu)較模糊，會影響顯微切割的準(zhǔn)確性。在做單細(xì)胞顯微切割或亞細(xì)胞顯微切割時，易出現(xiàn)鄰近非目的細(xì)胞碎片的污染。切片脫水不徹底，或是設(shè)定的激光的能量太低，有時會造成目的細(xì)胞無法從切片上彈射下來。69整理課件激光顯微切割技術(shù)的應(yīng)用

DNA分析基因表達(dá)分析蛋白質(zhì)分析單細(xì)胞分析70整理課件

DNA分析

雜合性缺失〔LOH〕DHPLC比較基因組雜交〔CGH，comparativegenomichybridisation〕71整理課件

基因表達(dá)分析

RT-PCRrealtimequantitativePCRcDNAarray序列基因表達(dá)分析〔serialanallysisofgeneexpression〕72整理課件

單細(xì)胞分析

基因突變病毒DNA序列的插入免疫球蛋白基因序列重排蛋白質(zhì)分析cDNAarray可用如全基因組擴(kuò)增的模板，得到表達(dá)文庫73整理課件ABCA:鏡下選擇病變區(qū)域B：標(biāo)出所要切割的病變區(qū)域C：切割完畢后鏡下所見74整理課件冰凍切片的制作及其本卷須知75整理課件冰凍切片冰凍切片〔frozensection〕是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。76整理課件用途因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。顯示組織中的脂肪和脂類物質(zhì)，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等。神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。對某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。

77整理課件冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)：

簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。快速，用時短。組織變化不大。能很好保存脂肪，類脂等成分。能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機(jī)溶劑或熱耐受能力較差的細(xì)胞膜外表抗原和水解酶保存較好。78整理課件冰凍切片的缺點(diǎn)

不容易做連續(xù)切片。切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。不容易制作較薄的切片。組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，