可表達(dá)羊傳染性膿皰病毒f

可表達(dá)羊傳染性膿皰病毒f

羊感染（ce）也被稱為羊口傷口（orf），是由羊感染和艾滋病毒（或f.virs）引起的綿羊或山羊接觸性和嗜上皮性感染引起的。主要感染羔羊和幼羊,臨床表現(xiàn)以口唇、舌、鼻、乳房等皮膚和黏膜部位形成丘疹、結(jié)節(jié)、水皰、膿皰、潰瘍和疣狀厚痂為主要特征;本病自身癥狀輕微,但由于病畜采食障礙,常繼發(fā)或混合感染其他病原菌,從而引發(fā)較高的病死率。目前,該病廣泛流行于養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū),在我國(guó)主要分布在甘肅、寧夏、內(nèi)蒙、新疆、青海等地區(qū),常呈群發(fā)性流行;同時(shí)也可感染人類,作為一種人畜共患傳染病,其不僅嚴(yán)重危害我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也嚴(yán)重威脅著人類生存健康。因此預(yù)防該病的新型疫苗的研究迫在眉睫。羊傳染性膿皰病毒ORF059基因編碼39kDa的F1L蛋白,是主要的肝素結(jié)合活性蛋白,能夠與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)的硫酸乙酰肝素受體結(jié)合,因此認(rèn)為該蛋白在病毒吸附和入侵過(guò)程中起非常重要的作用。同時(shí)該蛋白還是Orfv囊膜蛋白的重要組成成分,是主要的免疫優(yōu)勢(shì)抗原,其既可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體,也可以通過(guò)阻止Orfv吸附宿主細(xì)胞而發(fā)揮免疫保護(hù)作用,從而利于機(jī)體清除病原體。因此,其成為Orfv新型亞單位疫苗研究的標(biāo)準(zhǔn)抗原。目前,痘病毒包括山羊痘病毒(Goatpoxvirus,Gpv)作為表達(dá)載體可保持蛋白的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性,其有效性已被大量研究所證實(shí)。因此,本研究選擇Orfv的F1L基因?yàn)槟康幕?構(gòu)建可高效表達(dá)F1L蛋白的重組山羊痘病毒,并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性、理化特性和免疫原性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià),為今后制備羊傳染性膿皰-羊痘基因工程活載體疫苗奠定基礎(chǔ),使同時(shí)預(yù)防山羊痘和羊傳染性膿皰病成為可能。1材料和方法1.1材料表面1.1.1ha細(xì)胞和pd18-t載體大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司;pUC-TK12-LacZ載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分離株山羊痘弱毒疫苗購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司;6-8周齡雌鼠購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;Orfv-shz分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定;BHK-21細(xì)胞、vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.3試劑與儀器方法TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNAMarker和病毒DNA提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司;Lipofectamine2000和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Goatanti-MouseIgG-HRP購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司;低熔點(diǎn)瓊脂糖、X-gal和各種抗生素均購(gòu)自德國(guó)Sigma公司;DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及超純RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR儀,德國(guó)Eppendorf;核酸電泳儀、凝膠成像儀,美國(guó)Bio-Rad公司;微量核酸蛋白分析儀,美國(guó)Thermo公司;sunrise酶標(biāo)儀,奧地利Tecan公司。1.2序列的合成本實(shí)驗(yàn)研究所用引物均根據(jù)GenBank中公布的序列,使用Primer5.0設(shè)計(jì),由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列見(jiàn)表1。1.3重組轉(zhuǎn)移載體uc-tk12-lacz-c1l的構(gòu)建1.3.1羊傳染性細(xì)胞中fpse.colidh5表達(dá)參照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit說(shuō)明書(shū)提取羊傳染性膿皰病毒基因組,并以其為模版擴(kuò)增F1L基因,經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pMD18-T連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng),提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR和酶切鑒定后送華大基因測(cè)序,將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-F1L。1.3.2fpsr檢測(cè)fps用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ分別對(duì)pUC-TK12-LacZ質(zhì)粒和pMD18-T-F1L質(zhì)粒進(jìn)行酶切,經(jīng)T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化,經(jīng)菌液PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證后送華大基因進(jìn)行測(cè)序,并用P1、P2作為測(cè)序引物鑒定轉(zhuǎn)移載體與F1L基因的連接方向。將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pUC-TK12-LacZ-F1L,簡(jiǎn)稱pTL-F1L。1.4山羊病毒rv-1l的構(gòu)建、篩選和鑒定1.4.1hk-21細(xì)胞同源重組將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000操作步驟轉(zhuǎn)染至已感染Gpv疫苗株的BHK-21細(xì)胞中,進(jìn)行同源重組,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)時(shí),收獲病毒液。將獲得的病毒液繼續(xù)感染細(xì)胞,并通過(guò)LacZ篩選標(biāo)記在含有X-gal的低熔點(diǎn)瓊脂上挑取藍(lán)色病毒蝕斑,如此反復(fù)純化5代,得到重組山羊痘病毒rGpv-F1L。1.4.2目的基因的pcr鑒定參照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit提取第5代重組山羊痘病毒的DNA,對(duì)目的基因F1L進(jìn)行PCR鑒定。1.5山羊痘基因的遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)將重組山羊痘病毒按照上述方法進(jìn)行連續(xù)的藍(lán)白斑篩選,純化至第20代,-80℃冰箱保存、備用。1.5.2目的基因fpsl檢測(cè)重組山羊痘病毒感染vero細(xì)胞后,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)加入Trizol進(jìn)行處理,按照超純RNA提取試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,對(duì)目的基因F1L進(jìn)行檢測(cè)。1.5.3羊口胞菌pbs的制備重組山羊痘病毒接種vero細(xì)胞后,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí),加入多聚甲醛4℃固定30min,PBS(由NaCl,KCl,Na2HPO4,NaH2PO4配制而成)漂洗細(xì)胞后加入羊口瘡病毒陽(yáng)性血清37℃反應(yīng)2h,再用PBS洗滌3次。然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗37℃反應(yīng)1h,PBS漂洗后置于熒光顯微鏡下觀察。1.5.4細(xì)胞裂解液ripa裂解細(xì)胞重組山羊痘病毒接種vero細(xì)胞,36-48h后收獲細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞。SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,以羊口瘡病毒陽(yáng)性血清為一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。1.6山羊角質(zhì)化特征的物理特性1.6.1tcid50的測(cè)定將重組山羊痘病毒懸液分別置于37℃、50℃、55℃和60℃水浴中,每個(gè)溫度各作用15min、30min、45min和1h,然后按照Reed-Muench法測(cè)定TCID50。1.6.2山羊痘的耐酸、耐堿試驗(yàn)分別將重組山羊痘病毒懸液經(jīng)pH值為3、5、7、9和11的PBS處理30min和1h,然后按上述方法測(cè)定TCID50。1.6.3tcid50的測(cè)定重組山羊痘病毒懸液經(jīng)終濃度為20%的氯仿4℃作用10min,取上清液測(cè)定TCID50。重組山羊痘病毒經(jīng)終濃度為20%乙醚4℃處理數(shù)小時(shí)后,取下層病毒液測(cè)定TCID50。1.6.4對(duì)山羊角色炎的敏感性測(cè)試重組山羊痘病毒液于垂直距離50cm、20W的紫外燈下分別照射15、30、45和1h,然后按照上述方法測(cè)定TCID50。1.6.5對(duì)作用條件敏感在外部作用條件下,實(shí)驗(yàn)組病毒滴度比對(duì)照組病毒滴度降低2個(gè)滴度及以上,判斷病毒對(duì)作用條件敏感,降低2個(gè)滴度以下,判斷病毒對(duì)該作用條件有一定的抵抗力。1.7間接elisa檢測(cè)分別用山羊痘病毒疫苗和重組山羊痘病毒rGpv-F1L免疫6-8周齡小鼠,每只以104.5TCID50/100μL劑量皮下注射。免疫后每10d斷尾采血,分離血清,進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。以感染vero細(xì)胞的羊傳染性膿皰病毒為包被抗原,經(jīng)包被液(NaHCO3緩沖液,pH9.6)稀釋后,按100μL/孔4℃包被過(guò)夜。用含2%BSA的封閉液37℃封閉2h,清洗后加入一抗血清,37℃孵育1h。再次清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的二抗,洗滌后,加入底物溶液(TMB)避光顯色15min,2mol/L硫酸終止反應(yīng)后,測(cè)定OD450值。2結(jié)果2.1fpsp擴(kuò)增后表達(dá)陽(yáng)性克隆菌的鑒定以羊傳染性膿皰病毒基因組為模板對(duì)F1L基因進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得了大小約為1023bp的特異性條帶。將F1L目的片段與轉(zhuǎn)移載體pUC-TK12-LacZ(pTL)連接、轉(zhuǎn)化后,對(duì)陽(yáng)性克隆菌的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證,獲得了預(yù)期大小的目的條帶。陽(yáng)性菌送華大基因測(cè)序,結(jié)果顯示我們成功獲得了重組轉(zhuǎn)移載體pTL-F1L。2.2山羊病毒rbsv-1l的篩選和初步確定2.2.1雙側(cè)脫b落BHK-21細(xì)胞接種山羊痘弱毒株病毒48-72h后,細(xì)胞形態(tài)由梭形逐漸變圓,體積縮小,且不斷聚集,進(jìn)而逐漸脫落(圖1-B)。將重組轉(zhuǎn)移載體pTL-F1L轉(zhuǎn)染至已感染山羊痘弱毒苗的BHK-21細(xì)胞,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí),收獲病毒液;并通過(guò)LacZ報(bào)告基因在含有X-gal的低熔點(diǎn)瓊脂上挑取藍(lán)色病毒蝕斑,經(jīng)過(guò)多輪篩選純化后,在第五代病毒液中可觀察到90%以上的藍(lán)色蝕斑(圖1-G),表明我們獲得了較純的重組山羊痘病毒rGpv-F1L。2.2.2pcr鑒定以第5代重組山羊痘病毒DNA為模板對(duì)F1L基因進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示:我們獲得了與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致的特異性條帶,大小約為1023bp。表明F1L基因已成功重組到山羊痘弱毒株病毒的基因組中。2.3重組山羊天花病毒的遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)2.3.1fpsl基因檢測(cè)分別以純化20代后的重組山羊痘病毒的DNA和RNA為模板,對(duì)目的基因F1L進(jìn)行檢測(cè),均獲得了預(yù)期大小的特異性目的條帶,表明重組山羊痘病毒的F1L基因能夠在BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。同時(shí)測(cè)序結(jié)果表明,目的基因F1L在重組病毒中無(wú)變異現(xiàn)象,遺傳穩(wěn)定性良好。2.3.2重組淮山烷毒的fps重組病毒感染vero細(xì)胞后,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),結(jié)果顯示,感染重組山羊痘病毒的vero細(xì)胞出現(xiàn)特異性的綠色熒光,說(shuō)明重組山羊痘病毒F1L基因能夠在vero細(xì)胞中表達(dá)。而陰性對(duì)照組中,接種山羊痘弱毒株病毒的vero細(xì)胞未呈現(xiàn)綠色熒光反應(yīng)(圖2)。2.3.3羊傳染性細(xì)胞印跡檢測(cè)重組山羊痘病毒感染細(xì)胞后,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí),裂解細(xì)胞,用羊傳染性膿皰病毒陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示,在39kDa處可見(jiàn)一特異性條帶,說(shuō)明重組山羊痘病毒在細(xì)胞中表達(dá)了F1L蛋白(圖3)。2.4山羊角質(zhì)化特征的物理特性2.4.1tcid50的計(jì)算不同溫度處理的重組病毒接種細(xì)胞后,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞病變,依據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算TCID50。從表2中可以看出,重組病毒經(jīng)50℃水浴作用1h、55℃水浴作用30min或60℃水浴15min,即可被滅活(表2)。2.4.2反應(yīng)時(shí)間的確定重組病毒rGpv-F1L經(jīng)pH值為3、5、7、9及11的PBS,37℃分別作用30min和1h。其對(duì)BHK細(xì)胞的感染性結(jié)果顯示:在pH為5和9溶液中作用1h,重組病毒仍具有一定的耐受性,而pH值為3和11時(shí),其對(duì)重組病毒具有一定的滅活效果(表3)。2.4.3tcid50分別經(jīng)乙醚和氯仿處理的重組病毒,感染細(xì)胞,測(cè)定TCID50。結(jié)果顯示:病毒經(jīng)乙醚或氯仿處理后,病毒滴度均呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì),說(shuō)明該重組病毒對(duì)乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑較敏感(表4)。2.4.4不同濃度的紫外照射重組病毒在垂直距離50cm,功率為20W的紫外燈下照射不同時(shí)間后,病毒滴度比對(duì)照組降低2個(gè)滴度以上,說(shuō)明該重組病毒對(duì)紫外照射較敏感(表5)。2.5間接elisa檢測(cè)重組病毒rGpv-F1L免疫小鼠后,分離血清,進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示,免疫rGpv-F1L的小鼠40d內(nèi)可持續(xù)產(chǎn)生較高水平的F1L特異性抗體,與Gpv對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)(圖4)。3重組病毒的理化特性羊傳染性膿皰病是一種急性、高度接觸性的人獸共患病,該病發(fā)病率高,給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也直接威脅著人類健康。目前用于預(yù)防羊傳染性膿皰病的疫苗主要是弱毒疫苗,其存在毒力返強(qiáng)、對(duì)易感動(dòng)物有一定危險(xiǎn)性、免疫效果易受多種因素影響且保存和運(yùn)輸具有一定限制等缺點(diǎn)。本研究以山羊痘病毒疫苗為載體構(gòu)建可高效表達(dá)羊傳染性膿皰病毒優(yōu)勢(shì)抗原基因F1L的重組二聯(lián)活疫苗候選株rGpv-F1L,期望能同時(shí)預(yù)防山羊痘病毒和羊傳染性膿皰病毒的感染,實(shí)現(xiàn)一種疫苗預(yù)防兩種疾病,以便在生產(chǎn)和使用中比兩種疫苗聯(lián)合免疫產(chǎn)生更顯著的效果。尤其重要的是,重組山羊痘病毒rGpv-F1L活載體疫苗候選株可以與Orfv野毒感染相區(qū)別,不干擾血清學(xué)檢測(cè),克服了現(xiàn)有羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗的缺陷。羊傳染性膿皰病毒與山羊痘病毒都屬于痘病毒科,有交叉免疫效果。同時(shí)其與山羊痘病毒具有相同或相似的宿主范圍;本研究使用的山羊痘病毒疫苗載體具有基因組結(jié)構(gòu)龐大、可容納較大外源基因、使用較安全等特點(diǎn),其進(jìn)入機(jī)體后可自行復(fù)制,并表達(dá)外源蛋白。國(guó)內(nèi)外近年來(lái)有將Gpv作為疫苗載體的研究報(bào)道,并有不少反芻獸類動(dòng)物病毒的保護(hù)性抗原基因在Gpv疫苗載體表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá),顯示出了良好的應(yīng)用前景。本文構(gòu)建的重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體含有一個(gè)來(lái)源于山羊痘病毒早期轉(zhuǎn)錄因子和中期轉(zhuǎn)錄因子起始密碼子之間大小為56bp的雙向啟動(dòng)子,能夠高效的表達(dá)外源蛋白;同時(shí)插入的報(bào)告基因可形成肉眼可見(jiàn)的藍(lán)色病毒蝕