小鼠肝臟病理學(xué)改變的實驗研究

小鼠肝臟病理學(xué)改變的實驗研究

肝炎病毒（hbv）可能會導(dǎo)致各種急性和慢性肝疾病、肝硬化疾病，以及與肝腫瘤（hcl）密切相關(guān)的肝細胞癌的發(fā)生。關(guān)于HBV導(dǎo)致HCC的機制,目前認為與HBV基因組整合入宿主基因組有關(guān)。王友亮等采用基因敲入的方法,通過同源重組和ES細胞培養(yǎng)技術(shù),將HBV的表面抗原基因定位地引入小鼠基因組p21位點中,通過顯微注射和胚胎移植技術(shù),獲得能穩(wěn)定表達HBV表面抗原的p21HBsAgHBsAgHBV轉(zhuǎn)基因小鼠。本文對該轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟,進行大體標(biāo)本、光鏡、透射電鏡的病理學(xué)研究。1材料和方法1.1血清hbsag基因和野生型小鼠的篩選實驗動物共分二組:SPF級p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠和p21++野生型小鼠。以上二組小鼠分為2、6、12、18、24五個月齡段。小鼠處死前一直維持在SPF級狀態(tài)。1.2主試劑常規(guī)組織固定和組織切片試劑,常規(guī)HE染色試劑,常規(guī)電鏡試劑。1.3病理組織學(xué)檢測采用斷頸椎法處死小鼠,肉眼觀察各組小鼠外觀,仔細觀察詳細記錄小鼠各臟器特別是肝臟的位置、大小、色澤、形狀、質(zhì)地、表面和切面的病理改變。立即取下肝臟、肝臟腫瘤和腫大的淋巴結(jié)等組織,光鏡取材:組織塊厚度為1～1.5cm,用pH7.3濃度為0.1molLPBS緩沖液沖洗,固定于10%中性甲醛固定液;電鏡取材:用干凈雙面刀片在固定液中把組織切成1mm3的小塊,固定于多聚甲醛-戊二醛固定液中。1.4組織病理學(xué)觀察初取材的組織固定于10%中性甲醛固定液48h后精細取材,所取組織塊大小為1.5～2.0cm,厚度為0.15～0.2cm,4℃下組織脫水透明,52℃低熔點石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,HE染色,光鏡下觀察。1.5透射電鏡檢查4℃下1mm3大小組織塊固定于多聚甲醛-戊二醛固定液中24h,用pH7.3濃度為0.1molLPBS緩沖液沖洗并過夜,逐級緩慢脫水,Epon812浸透和包埋,超薄切片,醋酸鈾(鉛)雙染色,PhilipsCM120透射電鏡觀察。2結(jié)果2.1p2p1.2.4小鼠肝臟疾病剖檢p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠288只,其中132只雄性,156只雌性。肉眼觀察58只小鼠出現(xiàn)病變。病變雌雄間差別不明顯。病變主要集中在肺、肝、脾三個器官上,表現(xiàn)為肺臟的淤血出血、脾臟的腫大、脾臟出現(xiàn)白色的壞死病灶;肝臟病變不明顯,個別小鼠肝臟體積略增大。剖檢p21++野生型小鼠20只,雌雄各半,除1例脾臟略腫大外,其他臟器未查見明顯病變。剖檢p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠168只,其中90只雄性,78只雌性。肉眼觀察76只小鼠出現(xiàn)病變。病變雌雄間差別不明顯。病變主要集中在肝臟上,表現(xiàn)為肝臟體積增大,伴有輕度的黃疸,表面有油膩感,質(zhì)地正?；蛏源嗳?。有的小鼠肝臟色深紅,質(zhì)地變硬,紋理增粗。少數(shù)肝臟有壞死,壞死灶呈白色或灰色,壞死灶多為一個。剖檢p21++野生型小鼠20只,雌雄各半,除3例脾臟略腫大,1例肝臟有針尖大壞死灶外,其他臟器未查見明顯病變。剖檢p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠42只,其中23只雄性,19只雌性。肉眼觀察34只小鼠出現(xiàn)病變。病變雌雄間差別不明顯。病變主要集中在肝臟上,病理變化同6月齡小鼠基本相似。剖檢p21++野生型小鼠20只,雌雄各半,除2例肝臟略腫大外,其他臟器未查見明顯病變。剖檢p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠10只,雌雄各半,肉眼觀察8只小鼠出現(xiàn)病變。病變主要集中在肝臟上,表現(xiàn)為肝臟體積增大,明顯腫脹,肝臟顏色發(fā)暗,質(zhì)地變硬,邊緣圓鈍,切面可見出血壞死。4只雄性小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤,見腫瘤單個或兩個,大者1cm3,小者0.2cm3,有的大結(jié)節(jié)性腫瘤切面出血壞死,有的患腫瘤的小鼠出現(xiàn)脾臟腫大,腸系膜淋巴結(jié)腫大。剖檢p21++野生型轉(zhuǎn)基因小鼠21只,其中8只雄性,13只雌性。除3例肝臟略腫大外,其他臟器未查見類同于p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的病變。18月齡p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟腫瘤見圖1-a(見彩插2)。剖檢p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠10只,雌雄各半,肉眼觀察小鼠全部出現(xiàn)病變。病變基本同18月齡轉(zhuǎn)基因小鼠。5只雄性小鼠和1只雌性小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤,見腫瘤單個、多個或彌漫性分布,大者1.5cm3,小者0.4cm×0.4cm×0.3cm,有的腫瘤周圍有“衛(wèi)星”結(jié)節(jié)。剖檢p21++野生型轉(zhuǎn)基因小鼠19只,其中10只雄性,9只雌性。未查見類同于p21HBsAgHBsAg二種轉(zhuǎn)基因小鼠的病變。24月齡p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟腫瘤見圖1-b(見彩插2)。2.2sag基因突變2.2.12月齡小鼠:肝小葉結(jié)構(gòu)完整,個別小鼠出現(xiàn)肝細胞濁腫,未查見其他明顯病變,二組小鼠間差別不明顯。2.2.26月齡小鼠:p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝細胞濁腫,淋巴細胞浸潤,輕度脂肪變性,輕度不典型增生。p21++野生型小鼠未查見明顯病變。2.2.312月齡小鼠:p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝細胞腫脹,中央靜脈擴張,小膽管增生,點灶狀或碎屑樣壞死,肝竇狹窄,門管區(qū)淋巴細胞浸潤,輕度-中度脂肪變性,輕度-中度不典型增生,門管區(qū)卵圓細胞增生。p21++野生型小鼠,除個別肝臟肝細胞腫脹,輕度脂肪變性外,未查見明顯病變。12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織病理分析見圖2(見彩插2)。2.3小鼠肝臟腫瘤組織顯微結(jié)構(gòu)變化2、6、12月齡p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝細胞線粒體輕度腫脹。p21++野生型小鼠未查見明顯病變。18、24月齡小鼠出現(xiàn)的肝腫瘤超微形態(tài)差別不大,可見癌細胞排列緊密,大小較一致,多數(shù)呈六角形,細胞質(zhì)豐富,可見微膽管,核仁增大,細胞核形態(tài)發(fā)生改變,表現(xiàn)為核膜曲折凹陷,染色質(zhì)結(jié)集趨邊,核仁分離碎裂。線粒體腫脹,表現(xiàn)為線粒體變大、變圓、基質(zhì)變淡、嵴變短、變少、甚至消失、變成空泡狀結(jié)構(gòu);24月齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟腫瘤組織顯微結(jié)構(gòu)分析見圖5(見彩插2)。原發(fā)灶癌細胞顯微結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移灶癌細胞顯微結(jié)構(gòu)極為相似。24月齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶組織顯微結(jié)構(gòu)分析見圖6(見彩插2)。3hbsag基因轉(zhuǎn)染小鼠肝臟癌的組織病理特征HCC的發(fā)生和發(fā)展與HBV感染密切相關(guān),HBV在自然狀態(tài)下只感染人和高等靈長類動物,制作轉(zhuǎn)基因小鼠模型,有利于在活體水平對HBV感染及后果進行實驗研究。自從1985年美國學(xué)者Chisari等構(gòu)建成功第一個含有HBV基因的轉(zhuǎn)基因小鼠以后,國內(nèi)許多實驗室相繼構(gòu)建成表達不同HBV基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,但轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟是否有明顯病理損害說法不一。余宏余等和胡衛(wèi)江等研究認為,轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠肝臟病理學(xué)分析未見明顯差異,在轉(zhuǎn)基因小鼠整個生命周期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的肝臟病理改變。熊俊等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟輕度變性,其他未查見明顯病理改變?？祼劬妊芯堪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟產(chǎn)生局部明顯的炎癥反應(yīng),細胞變性,局部可見巨核肝細胞,并發(fā)現(xiàn)患肝細胞癌的轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究發(fā)現(xiàn),p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠隨著月齡的增加,肝細胞變性和增生越來越明顯,6月齡、12月齡出現(xiàn)肝細胞灶性壞死伴淋巴細胞浸潤,脂肪變性,不典型增生,個別肝臟壞死性小灶形成;18、24月齡轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生肝細胞癌,病理分型以結(jié)節(jié)型為主,鏡下多呈索狀梁狀型,高分化。24月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細胞癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。肝細胞癌多見于男性,在高發(fā)區(qū)男女發(fā)病率之比可高達16∶1。本研究發(fā)現(xiàn)18月齡到24月齡之間的發(fā)生肝細胞癌的轉(zhuǎn)基因小鼠,雄雌發(fā)病率之比為9∶1,提示HBsAg基因與雄性小鼠發(fā)生肝細胞癌相關(guān)。這種雄性轉(zhuǎn)基因小鼠易發(fā)生肝細胞癌,與人類男性HBV感染者更容易發(fā)展成肝細胞癌的情況相一致。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個重要標(biāo)志,所謂腫瘤的轉(zhuǎn)移,是指腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤部位脫離、遷徙到與原發(fā)腫瘤不同的位點,不斷生長,最終發(fā)展為腫瘤的整個過程。肝細胞癌由于其組織結(jié)構(gòu)的特點,容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移,在肝細胞癌患者尸檢中發(fā)現(xiàn)50%～84.6%有轉(zhuǎn)移。目前,未查見HBV轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生的肝癌有轉(zhuǎn)移的文獻報道。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的肝癌模型動物,只有發(fā)現(xiàn)確切的肝癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移,才為真正意義上的肝癌模型。本研究發(fā)現(xiàn)2例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移的癌細胞形態(tài)和原發(fā)灶癌細胞形態(tài)極為相似。所以該p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為理想的肝癌細胞模型動物。2.2.418月齡小鼠:大部分p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠,肝細胞出現(xiàn)濁腫,肝細胞體積增大,細胞核也增大,染色較深,匯管區(qū)及小血管周圍有較多的淋巴細胞浸潤,中度-重度脂肪變性,中度-重度不典型增生。4例p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠大體解剖時發(fā)現(xiàn)的肝臟腫瘤,鏡下病理診斷為肝細胞癌,肝細胞癌呈高分化,類似肝細胞,形成索狀和腺泡狀結(jié)構(gòu)。癌細胞呈多角形,境界清楚,胞質(zhì)豐富,核大圓形,核仁明顯。核中度-重度異形,染色質(zhì)粗大,數(shù)目增多,深染,有單核或多核,個別出現(xiàn)核樣體及包涵體,核分裂相多見,可見瘤巨細胞。p21++野生型小鼠除肝臟肝細胞腫脹,淋巴細胞浸潤,脂肪變性外,未查見類同于p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的病變。18月齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟腫瘤組織病理分析見圖3(見彩插2)。2.2.524月齡小鼠:p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝細胞和肝細胞癌鏡下形態(tài)基本同18月齡小鼠。6例p21HBsAgHBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠大體解剖時發(fā)