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桂枝甘草湯及其提取物組分抗心律失常作用的實驗研究

桂枝甘草湯是溫陽心陽的基礎(chǔ)。漢代張仲景的《傷寒論脈證結(jié)合治療》一文寫道:“出汗過多,別人的手冒著心臟,感到心悸和割傷。主要是桂枝甘草湯?!薄,F(xiàn)代臨床多以本方為基礎(chǔ)方治療“心悸”等相關(guān)病證。更有不少臨床報道表明,本方對不同類型心律失常均具有較好的療效。本研究從多種心律失常動物模型研究入手,應(yīng)用現(xiàn)代工藝對桂枝甘草湯提取分離,通過動物實驗確定桂枝甘草湯抗心律失常的作用機理及其相應(yīng)的活性組分。1實驗材料1.1電子分析天平MedLab多道生物信號分析系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);電子分析天平(德國artorius);DDB型微量蠕動泵(上海之信儀器有限公司)。1.2實驗動物及設(shè)備Wistar大鼠,140只,雌雄各半,體重200~220g,豚鼠64只,雌雄各半,280~300g,均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.3桂枝甘草湯及其它組分水合氯醛,氯化鋇,氨基甲酸乙酯(中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司);桂枝甘草湯及各組分(自制);硫酸奎尼丁(批號040902,上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司);烏頭堿(純度>95.5%,上海同田生化技術(shù)有限公司);哇巴因(純度>95.5%,sigma公司)。2實驗方法2.1藥物的制備和組成2.1.1桂枝甘草湯、甘草湯組的制備桂枝甘草湯各個組分的制備:桂枝、甘草按2:1的比例加10倍量水,用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油,藥渣加10倍量水煎煮30min,煎液合并,加熱濃縮成膏狀,上AB-8x型大孔樹脂柱,以蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇洗脫,分別得到桂枝甘草湯水組分、桂枝甘草湯30%、60%乙醇組分,各組分均定容至1.26g·ml-1生藥量濃度,低溫儲存?zhèn)溆?。桂枝甘草湯的制?桂枝、甘草按2:1的比例加10倍量水,浸泡30min,沸騰20min,濾出藥液,再加10倍量水煎煮20min濾出藥液。合并2次藥液,低溫蒸發(fā)濃縮至1.26g·ml-1生藥量濃度,低溫儲存?zhèn)溆谩?.1.2制備桂枝甘草湯模型①桂枝甘草湯提取物水組分組(簡稱水組分);②桂枝甘草湯提取物30醇組(簡稱30醇組);③桂枝甘草湯提取物60醇組(簡稱60醇組);④桂枝甘草湯全方組(簡稱全方組);⑤桂枝甘草湯揮發(fā)油組(簡稱揮發(fā)油組);⑥模型組;⑦陽性藥(硫酸奎尼丁)對照組。2.2心律失常事件Wistar大鼠,70只,雌雄各半,隨機分成七組,每組10只。給藥量:桂枝甘草湯及其各提取物組分給藥量相當于6.48g·kg-1生藥量;模型組給予等體積蒸餾水,陽性對照組按15mg·kg-1給藥。實驗前進行預(yù)防給藥,給藥后1h進行實驗。用10%水合氯醛(300mg·kg-1)將大鼠腹腔麻醉,記錄正常II導(dǎo)聯(lián)心電圖,棄去心電不正常的大鼠,舌下靜脈注射0.4%BaCl2(4mg·kg-1),4s內(nèi)注入完畢,分別記錄心律失常發(fā)生率、出現(xiàn)時間及持續(xù)時間。發(fā)生率用Fisher確切概率法檢驗,出現(xiàn)時間及持續(xù)時間用t檢驗統(tǒng)計顯著性。2.3烏蘇葉、管理、實驗Wistar大鼠,70只,雌雄各半,隨機分成七組,每組10只。給藥量:桂枝甘草湯及其各提取物組分別給予藥量相當于6.48g·kg-1的生藥量;模型組給予等體積蒸餾水,陽性對照組按15mg·kg-1給藥。烏頭堿的配制:以0.1mol·L-1HCl溶解,生理鹽水稀釋,以1mol·L-1NaOH調(diào)pH至6,生理鹽水定容(8μg·ml-1),冰箱保存,3天內(nèi)有效。實驗前進行預(yù)防給藥,每天1次,連續(xù)5d,第5d給藥1h后進行實驗。取大鼠,用25%烏拉坦(6ml·kg-1)腹腔注射麻醉,然后將大鼠背位固定在手術(shù)臺上。啟動Medlab生物信號采集處理系統(tǒng),連接II導(dǎo)聯(lián)心電圖,用恒速蠕動泵由舌下靜脈以2μg·min-1的恒速注入烏頭堿溶液,分別觀察和記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖及引起室性早搏(VP)、室性心動過速(VT)、心室顫動(VF)、心臟停搏(CA)時所用的時間,換算成烏頭堿的等效閾劑量,并進行t檢驗。2.4mg甲基-1給藥豚鼠56只,隨機分成七組,每組8只。給藥量:桂枝甘草湯及其各提取物組分別給予藥量相當于5.58g·kg-1生藥量;模型組給予等體積蒸餾水,陽性對照組按30mg·kg-1給藥。實驗前進行預(yù)防給藥,每天1次,連續(xù)5天,第5天給藥后1h進行實驗。取鼠,用烏拉坦(1.2g·kg-1)麻醉,仰位固定,四肢皮下插入針狀電極,以Medlab生物信號記錄分析系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)視并記錄ECG,頸外靜脈插管,動物心電穩(wěn)定后,經(jīng)頸外靜脈以3μg·min-1速度給予哇巴因,記錄ECG,分別觀察和記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖及引起室性早搏(VP)、室性心動過速(VT)、心室顫動(VF)、心臟停搏(CA)所用的時間并換算成哇巴因的等效閾劑量,進行t檢驗。3結(jié)果3.1組患者發(fā)生情況對比如表1所示:①30醇組、全方組、陽性藥組,均可明顯抑制氯化鋇誘發(fā)大鼠心律失常的發(fā)生,與模型組比較,P<0.05;②水組分、陽性藥對照組、30醇組可明顯延遲氯化鋇誘發(fā)大鼠心律失常的出現(xiàn)時間(P<0.01或P<0.05);③水組分、30醇組、陽性藥對照組、全方組可明顯縮短氯化鋇誘發(fā)大鼠心律失常的持續(xù)時間(P<0.01)。3.2不同給藥劑量對烏蘇烷室性早博弈、室性心動過速、心臟停索的影響模型組在恒速iv烏頭堿數(shù)分鐘后即可出現(xiàn)室性早搏,漸有二聯(lián)律、三聯(lián)律出現(xiàn),進而形成連續(xù)的室性心動過速,發(fā)展為心室纖顫直至心臟停搏。如表2所示:30醇組、水組分、全方組、陽性藥組可明顯增加烏頭堿誘發(fā)致大鼠發(fā)生室性早搏(VP)、室性心動過速(VT)、心室纖顫(VF)、心臟停搏(CA)的烏頭堿閾劑量(P<0.01或P<0.05);60醇組、揮發(fā)油組作用不明顯(P>0.05)。3.3蘇氏原螯蝦對心動過速的影響模型組在恒速iv哇巴因數(shù)分鐘后即可出現(xiàn)室性早搏,漸有二聯(lián)律、三聯(lián)律出現(xiàn),進而形成連續(xù)的室性心動過速,發(fā)展為心室纖顫直至心臟停搏。如表3所示:水組分、30醇組、全方組、陽性藥組可明顯增加哇巴因致豚鼠發(fā)生室性早搏(VP)、室性心動過速(VT)、心室纖顫(VF)、心臟停搏(CA)的哇巴因閾劑量(P<0.01或P<0.05);60醇組、揮發(fā)油組作用不明顯(P>0.05)。4遲心律失常事件我們通過實驗發(fā)現(xiàn)桂枝甘草湯及其提取物30醇組分、水組分能夠不同程度地阻止氯化鋇所誘發(fā)的心律失常,推遲心律失常的發(fā)生時

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