人民醫(yī)院基因擴增實驗室肺炎支原體核酸定量檢測標準操作程序

人民醫(yī)院基因擴增實驗室肺炎支原體核酸定量檢測原則操作程序項目名稱肺炎支原體核酸定量檢測檢查辦法名稱TaqMan熒光定量檢測辦法學原理用一對肺炎支原體特異性引物和一條肺炎支原體特異性熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一種熒光報告基團（R）和一種熒光淬滅基團（Q）。探針完整時，R基團發(fā)射的熒光信號被Q基團吸?。籔CR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使R熒光基團和Q熒光基團分離，Q基團對R基團的克制吸取作用消失，熒光監(jiān)測系統(tǒng)就可接受到R基團的熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一種熒光分子形成。被切割產(chǎn)生的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例，這樣就實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同時。因此根據(jù)PCR反映液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。標本規(guī)定合用標本類型：痰液、咽拭子等。標本采集（泌尿生殖道分泌物）痰液—使用一次性吸痰器，患兒取仰頭平臥位，將吸痰管緩緩插入咽喉部，調(diào)節(jié)負壓，將氣管深部分泌物（在霧化吸入后效果較好）緩緩吸入儲液瓶中，重復多次，儲液瓶中分泌物即為標本，密封送檢。咽拭子—用咽拭子取咽部分泌物（多數(shù)會有粘稠的痰液），將咽拭子置入無菌玻璃管，密封送檢。標本保存：標本可立刻用于測試，也能夠保存于-20℃待測，保存期為6個月。試劑試劑名稱：肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）生產(chǎn)廠家：中山大學達安基因股份有限公司；試劑貨號：#DA-B064；包裝規(guī)格：20人份/盒；試劑成分：構(gòu)成部分數(shù)量DNA提取液（500μl/管）2管MPPCR反映液（400μl/管）2管Taq酶（60μl/管）1管MP陰性質(zhì)控品（50μl/管）1管MP強陽性質(zhì)控品（50μl/管）1管MP弱陽性質(zhì)控品（50μl/管）1管MP陽性定量參考品（1.0×105基因拷貝/ml）10μl/管1管MP陽性定量參考品（1.0×106基因拷貝/ml）10μl/管1管MP陽性定量參考品（1.0×107基因拷貝/ml）10μl/管1管MP陽性定量參考品（1.0×108基因拷貝/ml）10μl/管1管試劑儲存條件：保存于—20℃，使用期6個月。儀器ABI7500全自動基因擴增檢測儀操作環(huán)節(jié)DNA提取陰性質(zhì)控品解決向陰性質(zhì)控品管中加入等量DNA提取液充足混勻，100℃恒溫解決10±1分鐘；1r/min離心5min，備用。標本解決痰液痰液中加入4倍體積的生理鹽水，用1ml的槍頭重復吹打后置4℃冰箱過夜，使痰液充足液化；用槍頭或吸管混勻后吸取1ml至1.5ml離心管中，12,000rpm離心5分鐘；去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液充足混勻，100℃恒溫解決10±1分鐘；12,000rpm離心5分鐘，備用。咽拭子向玻璃管中加入1.5ml滅菌生理鹽水，充足震蕩搖勻，擠干棉拭子，立刻離心；或置4℃冰箱過夜；12,000rpm離心5分鐘，沉淀加滅菌生理鹽水1ml混勻，12,000rpm離心5分鐘；下列環(huán)節(jié)同7.1.2.1環(huán)節(jié)c、d。MP弱陽性質(zhì)控品解決（同陰性質(zhì)控品）；MP強陽性質(zhì)控品解決（同陰性質(zhì)控品）；MP陽性定量參考品解決：8000rpm離心數(shù)秒，備用；PCR擴增試劑準備（在試劑準備區(qū)操作）：按比例（MPPCR反映液40μl/人份+Taq酶3μl/人份）取對應量的PCR反映液及Taq酶，充足混勻后按43μl/管分裝至0.2ml離心管中備用。加樣：向準備好試劑的0.2ml離心管中，分別加入解決后的樣品（涉及樣本、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品）上清液2μl，或直接加入陽性定量參考品2μl，8000rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。設立PCR循環(huán)擴增程序以下93℃2分鐘預變性；93℃45秒→55℃60秒10個循環(huán)93℃30秒→55℃45秒30個循環(huán)成果判斷：陰性成果鑒定：如果增加曲線不呈S型或Ct值=30，則實驗成果判為樣品的UUDNA總含量不大于檢測極限。陽性成果鑒定：如果增加曲線呈S型曲線且Ct值<30，則：若樣品的Qty≤1×108，則痰液標本的MPDNA含量=Qty/4基因拷貝/ml，咽拭子標本的MPDNA含量=Qty/20基因拷貝/ml；若實驗成果，樣品的Qty>1×108，則痰液標本的MPDNA含量為>2.5×107基因拷貝/ml，咽拭子標本的MPDNA含量>5×106基因拷貝/ml。如果需要精擬定量成果，可將提取后的樣品稀釋100倍再檢測。若樣品的Qty<1×104，則痰液標本的MPDNA含量<2.5×103基因拷貝/ml，咽拭子標本的MPDNA含量<500基因拷貝/ml；質(zhì)控陰性質(zhì)控品：全部陰性；陽性質(zhì)控品：全部陽性，且強陽性質(zhì)控品檢測值允許范疇在2.5×106基因拷貝/ml~4.0×107基因拷貝/ml范疇，弱陽性質(zhì)控品定量參考值在2.5×104基因拷貝/ml~4.0×105基因拷貝/ml范疇；（參考值為儀器自動分析計算出的數(shù)值）；陽性定量參考品：均為陽性，且線性有關系數(shù)0.97≤|r|≤1；以上規(guī)定需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。參考范疇低于檢測下限性能指標敏捷度：1.0×104基因拷貝/ml線性范疇：1.0×104基因拷貝/ml~1.0×108基因拷貝/ml臨床意義肺炎支原體是呼吸道感染較常見的致病菌，近幾年有增加趨勢，感染后除引發(fā)以往認為的非典型肺炎外，還可引發(fā)肺外各系統(tǒng)變化，且有死亡病例報道。采用PCR辦法檢測肺炎支原體DNA，可早期、快速、精確、敏感地診療肺炎支原體感染。注意事項實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓，實驗過程嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；為試劑和標本制備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；對每次實驗進行質(zhì)量控制；試劑使用前要完全解凍，但應避免重復凍融；自備滅菌生理鹽水；標本解決時“去上清”環(huán)節(jié)，注意吸頭不要碰觸沉淀；試劑盒DNA提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時需用加樣器充足混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細不能吸取或取樣后堵塞吸頭現(xiàn)象，可先用干凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截；標本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈解決工作臺和移液器；全部檢測樣品應視為含有傳染性物質(zhì)，操作和解決均需符合有關法規(guī)規(guī)定：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。參考文獻中華人民共和