高效液相色譜法測定生地與地膜的成分比較

高效液相色譜法測定生地與地膜的成分比較

地黃是玄參科植物的新鮮或干燥土壤。鮮地黃清熱生津、涼血、止血、用于熱病傷陰,舌絳煩渴,發(fā)斑發(fā)疹,吐血,衄血,咽喉腫痛。生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰、生津,用于熱病舌絳煩渴、陰虛內(nèi)熱、骨蒸勞熱、內(nèi)熱消渴、吐血、衄血、發(fā)斑發(fā)疹。熟地黃滋陰補(bǔ)血、益精填髓,用于肝腎陰虛、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、心悸怔忡、月經(jīng)不調(diào)、崩漏下血、眩暈、耳鳴、須發(fā)早白?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),地黃具有調(diào)節(jié)免疫功能,影響血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等各方面活性,并具有抗衰老及降血糖等多方面功效。本課題組多年來對地黃的降血糖機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)血糖的主要成分是地黃寡糖。文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)烯醚萜苷類中的梓醇可能是地黃降血糖作用的有效成分之一。加工炮制過程中有效成分的變化是其藥性發(fā)生改變的根本原因,因此本實(shí)驗(yàn)對炮制前后的地黃中梓醇和糖類進(jìn)行了研究,為地黃的炮制機(jī)制研究提供參考。1儀器、試劑與儀器SCL—6A高效液相色譜儀,ShimadzuRID—6A示差折光檢測器(日本),Millennium32色譜管理系統(tǒng);Waters高效液相色譜儀,Waters996紫外檢測器,Waters600泵;MettlerAE240電子分析天平(瑞典),SK7200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司),FZQ—2渦旋混合器(江蘇泰縣醫(yī)療器械廠),微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)。葡萄糖(北京化學(xué)試劑三廠),果糖(中國藥品生物制品檢定所,批號1504-200001),半乳糖(德國EMERCK公司),楝二糖(Sigma-Aldrich,批號1362360),蔗糖(北京化學(xué)試劑三廠),棉子糖(西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司,批號DH258),水蘇糖(UnitedKingdom,批號065K3775)。生地藥材購于河南懷慶、河南新鄉(xiāng)、河南西峽等地,經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院曹宗鈞教授鑒定,與《中國藥典》2005年版一部正品相符,熟地藥材由同批生地根據(jù)《中國藥典》2005年版一部熟地黃“制法(2)項(xiàng)蒸法”及附錄ⅡD炮制而成,其他試劑均為分析純,水為重蒸水。2方法和結(jié)果2.1hplc法測定山羊成分2.1.1檢測設(shè)備和流程色譜柱為PhenomenexNH2柱(150mm×4.6mm,5μm),檢測器為ShimadzuRID—6A示差折光檢測器,流動(dòng)相為乙腈-水(72∶28),體積流量為1.0mL/min,柱溫為室溫,進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖1。2.1.2水蘇糖溶液的制備分別稱取葡萄糖、果糖、半乳糖、楝二糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖對照品8mg,精密稱定,置1.5mL離心管中,精密加1000μL水溶解,制成8mg/mL的溶液,0.45μm濾過,得濾液,備用。2.1.3超聲法提取液制備液制備液制備水液制備液分別稱取生地、熟地1g,精密稱定,加水20mL,超聲提取30min,放冷,用水定容至25mL,取1mL,5000r/min,離心,上清液0.45μm濾過,得濾液,備用。2.1.4蔗糖和蔗糖結(jié)果見表1。可見生地中的水蘇糖的量相對較高;熟地中的甘露三糖的量相對較高;二者中棉子糖的量也有較顯著的差異,生地中含35.1mg/g,熟地中含14.4mg/g;二者中蔗糖和楝二糖的量沒有顯著性差異;由于果糖是酮基六碳糖、葡萄糖和半乳糖是醛基六碳糖,結(jié)構(gòu)相近,色譜柱難以分離開,沒法測定,但是從生地和熟地水提取物的色譜圖可以看出熟地中的果糖的量高于生地。2.2銀醇hplc法的測定2.2.1檢測波長和測定波長Waters996紫外檢測器,Waters600泵,C18柱(150mm×4.6mm,5μm),檢測波長為210nm,流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶99),體積流量1.0mL/min,柱溫為室溫,進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖2。2.2.2流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液的制備稱取梓醇對照品適量,精密稱定,用流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶99)制成10μg/mL的溶液,0.45μm濾過,得到濾液,備用。2.2.3超聲-樣品法分別稱取生地、熟地0.5g,精密稱定,加甲醇5mL,超聲提取30min,放冷,用甲醇定容至5mL,濾過,水浴蒸干,殘?jiān)昧鲃?dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶99)溶解定容至5mL,0.45μm濾過,得到濾液,備用。2.2.4測量結(jié)果的比較結(jié)果見表2?？梢娚刂械蔫鞔嫉牧肯鄬^高,每克藥材含有2.04mg,熟地每克藥材含有0.322mg。3黃粱山地區(qū)對土壤糖等3種糖類化合物的活性檢測生地和熟地的糖類成分色譜圖中,成分基本一致,量有所變化,二者都含有果糖、葡萄糖、半乳糖3種單糖,蔗糖、楝二糖兩種二糖,棉子糖、甘露三糖兩種三糖,水蘇糖一種四糖;生地炮制成熟地后水蘇糖主要失去一個(gè)酮基單糖果糖,生成甘露三糖,所以熟地中甘露三糖和果糖的量較生地高;葡萄糖和半乳糖都是醛基六碳糖,保留時(shí)間分別為4.387、4.443min,二者很難分開。文獻(xiàn)報(bào)道,地黃中的寡糖含有少量的毛蕊四糖和毛蕊糖(五糖),但是在本研究的檢測條件下沒有檢測到。生地甲醇提取物及熟地甲醇提取物的HPLC色譜圖顯示,成分、量差別較大,其中生地明梓醇的量顯高于熟地。梓醇是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物,加工炮制過程中,脫去糖基而發(fā)生了一系列化學(xué)變化,導(dǎo)致梓醇大幅降低的同時(shí)出現(xiàn)了新的化合物。生地和熟地的糖類成分色譜圖與梓醇色譜圖顯示,糖類成分的量高,生地中水蘇糖量最高,達(dá)到166.3mg/g,楝二糖最低達(dá)到21.0mg/g,熟地中甘露三糖最高達(dá)到119.7mg/g,棉子糖最低達(dá)到14.4mg/g,梓醇的量相比較較低,生地2.04mg/g,熟地0.32mg/g。生地炮制成熟地,無論糖類成分還是環(huán)烯醚萜苷類成分均有不同程度地變化。其對地黃的藥效變化有何作用等問題,有待進(jìn)一步深入研究。對供試品溶液的計(jì)算,采用工作曲線回歸方程法和外標(biāo)一點(diǎn)法兩種方法。工作曲線回歸方程法計(jì)算供試品中水蘇糖的量和加樣回收