組織DNA提取原理和步驟詳細(xì)

組織DNA提取

TissueDNAExtraction1精選課件[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯學(xué)習(xí)從生物組織中提取DNA，為研究DNA的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能打好根底。2精選課件提取DNA總的原那么：

1保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。3精選課件粉碎組織DNP裂解液裂解細(xì)胞膜、核膜DNP苯酚、氯仿

DNA〔RNA〕RNA酶ProtaseＫ苯酚、乙醇

純DNA紫外定量原理：4精選課件各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母

Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞

Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母5精選課件破裂細(xì)胞、釋放核酸6精選課件DNA酚抽提法示意圖7精選課件DNA鑒定(DNAidentification)

濃度鑒定(concentration)純度鑒定(purity)完整性鑒定(integrity)8精選課件濃度鑒定

(concentrationidentification)1〕紫外分光光度法(ultravioletspectrophotometery)

測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸〕9精選課件各種堿基的紫外吸收光譜10精選課件2〕熒光光度法熒光染料溴化乙錠〔ethidiumbromide，EB〕，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。〔1-5ng〕11精選課件EB與DNA的結(jié)合12精選課件500

l全血提取的基因組DNA電泳動(dòng)物組織提取基因組DNA13精選課件純度鑒定(purityidentification)紫外分光光度法：在260nm和280nm處測(cè)定DNA溶液的光吸收，純的DNA，A260與A280之比應(yīng)在1.80；低于此值說明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值說明有RNA的殘留量。純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0。A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。14精選課件完整性鑒定(integrityidentification)凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。15精選課件核酸的貯存——DNA保存(storage)1〕短期貯存：4℃或-20℃存放于TE〔tris和EDTA〕緩沖液中。TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反響，pH低于7.0時(shí)DNA容易變性。2〕長期貯存：TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。16精選課件每克組織+ml裂解液組織勻漿器，勻漿取2.0ml勻漿，加等體積苯酚-氯仿，搖勻5min，2,500rpm10min

取水相加等體積氯仿-異戊醇,搖勻5min,2,500rpm10min方法：17精選課件取水相加5MNaCl至終濃度0.3MNaCl,加2.5倍體積冰無水乙醇，搖勻見白色沉淀,玻棒挑起

DNA70%乙醇洗滌一次沉淀溶于1mlTE

適當(dāng)稀釋紫外分光光度計(jì)測(cè)A260nm,A280nm18精選課件吸取DNA原液μl，用ddH2O稀釋至μl，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定A260nm及A280nm，計(jì)算A260nm/A280nm比值及DNA濃度。一般以A260nm/280nm≈1.8為標(biāo)準(zhǔn)。A260nm/A280nm假設(shè)＜1.6，提示有蛋白質(zhì)或酚污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。定量19精選課件DNA濃度〔μg/ml〕=A260nm×50×稀釋倍數(shù)×1/光徑*1OD值相當(dāng)于50μg/mldsDNA，40μg/mlssDNA或RNA，2Oμg/ml寡核苷酸。濃度計(jì)算20精選課件1.裂解液〔Homogenizationbuffer〕:10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA0.1mol/LNaCl1%SDSEDTA:抑制DNA酶活性試劑及其作用21精選課件SDS是離子型外表活性劑，主要功能：①溶解細(xì)胞膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；②解聚細(xì)胞中的核蛋白；③與蛋白形成復(fù)合物22精選課件2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):苯酚：強(qiáng)蛋白變性劑氯仿：蛋白變性劑，與水不互溶，與苯酚互溶，可以帶走剩余的酚。23精選課件為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的別離？苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA別離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。24精選課件3.氯仿-異戊醇〔Isoamyl-alcohol〕：能降低分子外表張力，所以能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白質(zhì)及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。25精選課件4.冰無水乙醇〔Absoluteethonal〕和70%乙醇(70%Ethonal):無水乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失去水而易于聚合；可除去剩余的氯仿。70%乙醇洗滌可去除剩余的鹽離子，鹽離子的存在會(huì)使之不易溶解，并可抑制酶反響。26精選課件5.TE緩沖液〔TEBuffer〕：10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA?緩沖對(duì)Tris-HCl不存在金屬離子的干擾作用?EDTA能穩(wěn)定DNA的活性。27精選課件6.20%SDS〔十二烷基磺酸鈉〕：抑制Dnase活性

28精選課件7.10mg/ml蛋白酶K(ProtaseK)：

分解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜

8.10mg/mlRNA酶(RNase)：分解RNA29精選課件9.5mol/LNaCl：

減少DNA分子間的同性電荷相斥力，使DNA易于相反聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。30精選課件DNA提取試驗(yàn)中常遇到

的問題基因組DNA收率較低或無基因組DNA樣本材料太少細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相別離不完全……31精選課件DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未去除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)參加蔗糖的原因參加多糖，保護(hù)DNA長度32精選課件[本卷須知]1.處死動(dòng)物取出所用臟器后應(yīng)盡快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在純化過程中要加核酸酶抑制劑(eg.EDTA),以防DNA自身降解。2.組織要盡量